白藜蘆醇對動脈粥樣硬化兔血脂及血清中抗氧化酶水平的影響＊

宋 蕊，陳艷宇，李婉秋，竇健霖，張 戈，孫 林△

（1.昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院心內科，昆明650101；2.廣東省第二人民醫(yī)院病理科，廣州510317）

在動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）和冠心病的發(fā)生、發(fā)展過程中，脂代謝異常是一重要的危險因素。有研究證實，降低冠心病患者的總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDLC）水平可大幅降低心血管事件病死率及事件再發(fā)生率［1-2］。大量的研究表明，白藜蘆醇能有效抑制脂質過氧化，抑制AS的形成，但其具體機制報道較少。本研究擬通過高脂飲食構建AS兔模型，觀察白藜蘆醇對AS兔血脂的影響，明確其抗脂質過氧化的作用，并闡述白藜蘆醇的抗氧化作用與促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）家族及核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）細胞信號通路之間的關系，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 普通級8周齡純種雄性日本大耳白兔50只，體質量2.2～2.6kg，健康，購自昆明醫(yī)科大學實驗動物科［許可證號：滇實動證第2005064 號，實驗動物設施合格證號：SCXK（滇）2011～0004］。分為對照組（A 組），高脂模型組（B組），白藜蘆醇低劑量組（C組），白藜蘆醇中劑量組（D 組），白藜蘆醇高劑量組（E組），每組10只。白藜蘆醇購自上海納貝生物公司；谷胱甘肽（glutathione，GSH）、谷胱甘肽過氧化物（glutathione peroxidase，GSH-PX）、谷胱甘肽硫基轉移酶（glutathione-S-transferase，GST）、γ-谷 氨 酰 半 胱 氨 酸 合 成 酶（γ-glutamyl cysteinyl synthetase，γ-GCS）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒購于南京建成生物工程所；NFκB、細胞外信號調節(jié)激酶1／2（extracellular signal regulated kinase1／2，ERK1／2）、絲裂原活化蛋白激酶（p38mitogen-activated protein kinase p38，p38 MAPK）、氨基末端激酶（c-Jun Nterminal protein kinase，JNK）、甘油醛-3-磷酸脫氫（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）鼠單克隆抗體，辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗鼠二抗購自美國Cell Signal Technology 公 司、美 國Santa Cruz 公 司；聚 偏 二 氟 乙 烯（PVDF）膜購自美國Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的制備 選取成熟健康雄性日本大耳兔50只，給予普通飼料（黃豆粉、麩皮、粗纖維、麥粉組成）適應性喂養(yǎng)7d后分成5組開始試驗（實驗0周），A 組繼續(xù)普通飼料喂養(yǎng)，B、C、D、E 組均高脂飼料喂養(yǎng)；C、D、E 組高脂飼料飼養(yǎng)10周后通過喂服膠囊分別給予白藜蘆醇15、45、80 mg·kg-1·d-1，連續(xù)給藥10周。高脂飼料配方為2.0%膽固醇＋10.0%豬油＋0.2%丙硫氧嘧啶＋87.8%基礎飼料［3］。每只兔子限制飼料100～120g／d，自由飲水。白藜蘆醇劑量根據(jù)參考文獻［4］確定。

1.2.2 采血測定血脂水平及血清抗氧化酶水平 實驗動物于第1、20周末，清晨空腹從兔耳中動脈采集血液2mL，靜置后離心分離血清，-20 ℃保存。全自動生化儀測定TC、TG、LDL-C、HDL-C 水平。按南京建成生物工程室提供試劑盒操作步驟測定CAT、SOD、GST、GSH、γ-GCS、MDA 水平。

1.2.3 Western blot檢測NF-κB和MAPKs信號通路蛋白表達 RIPA 法提取組織蛋白，以BCA 法進行蛋白定量后，取50 μg總蛋白，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）分離，PVDF 膜電轉移，5% 脫脂奶粉的TBST 緩沖液室溫封閉2h，加入一抗4 ℃孵育過夜；TBST 洗膜后與HRP標記的羊抗鼠二抗室溫孵育1h；TBST 洗膜，加入免疫印跡化學發(fā)光劑室溫下反應、暗室曝光、顯影和定影。掃描條帶，并用Image J1.43u軟件對成像結果進行分析，測定各個蛋白條帶的平均光密度值，根據(jù)平均光密度值進行統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS15.0 軟件進行分析，計量資料以±s表示，數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)檢驗均為正態(tài)分布，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）后Scheffe檢驗，進行組間兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 白藜蘆醇對血脂的影響 實驗第0周各組間血清TG、TC、LDL-C、HDL-C水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。第20周末，A 組與第0周對比有輕微變化，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；B、C、D、E組與同組第0周時相比及與同時期A組比較，TG、TC、LDL-C、HDL-C水平均明顯升高（P＜0.01）；與B組比較，C、D、E 組TG、TC、LDL-C 水平均有不同程度下降，HDL-C水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；C、D、E組間兩兩比較發(fā)現(xiàn)，TG、TC、LDL-C水平逐漸降低，HDL-C 水平逐漸升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結果顯示，白藜蘆醇對于血脂TG、TC、LDL-C、HDL-C 水平的影響呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性，見表1。

2.2 白藜蘆醇對血清抗氧化酶的影響 與A 組比較，B 組CAT、SOD 活力有所下降，而MDA 水平有所上升，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；給予白藜蘆醇干預后，CAT、SOD 活力隨著白藜蘆醇劑量的增加而增強，MDA 水平隨白藜蘆醇劑量的增加而降低，呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。與A 組 相 比，B 組GSH-PX 活 力 降 低，GSH 水 平、γ-GCS、GST 活力驟然升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；給予白藜蘆醇干預后，GSH 水平、GSH-PX 活力有所增強，γ-GCS、GST 活力則隨著白藜蘆醇劑量的增加而下降，呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3。

表1 第20周末各組血脂水平（±s，mmol／L）

表1 第20周末各組血脂水平（±s，mmol／L）

▲：P＜0.01，與A 組比較；★：P＜0.05，與B組比較；■：P＜0.01，與C組比較；◆：P＜0.05，與D組比較。

組別TC TG LDL-C HDL-C A組1.20±0.25 0.80±0.26 0.40±0.10 0.39±0.16 B組 35.95±3.84▲ 2.64±0.32▲ 20.62±2.24▲ 1.13±0.42▲C組 31.80±6.42▲★ 2.20±0.37▲★ 17.09±3.77▲★ 3.24±0.83▲★D組 25.45±4.01▲★■ 1.59±0.38▲★■11.49±2.90▲★■4.15±0.73▲★E組 19.67±7.30▲★■◆1.24±0.42▲★■◆8.43±2.78▲★■◆4.36±0.70▲★

表2 各組CAT、SOD 活力、MDA 水平比較（±s）

表2 各組CAT、SOD 活力、MDA 水平比較（±s）

▲：P＜0.01，與A 組比較，★：P＜0.05，與B組比較，■：P＜0.05，與C組比較，◆：P＜0.05，與D組比較。

組別 CAT（U／mL） SOD（U／mL） MDA（nmol／mL）A組18.29±2.56 84.00±10.39 2.37±0.56 B組 8.12±2.03▲ 58.24±7.39▲ 46.45±11.85▲C組 12.13±2.53▲★ 127.61±23.76▲★ 23.32±10.35▲★D組 16.17±3.34▲★■ 240.56±22.30▲★■ 19.43±4.60▲★■E組 15.27±3.51▲★■◆ 304.05±32.04▲★■◆ 9.63±2.66▲★■◆

表3 各組GSH 水平、GSH-PX、γ-GCS、GST 活力比較（±s）

表3 各組GSH 水平、GSH-PX、γ-GCS、GST 活力比較（±s）

▲：P＜0.01，與A 組比較；★：P＜0.05，與B組比較；■：P＜0.05與C組比較；◆：P＜0.05，與D組比較。

組別 GSH（g／L） GSH-PX（U／mL） γ-GCS（U／mL） GST（U／mL）A 組 10.11±1.61 288.04±43.60 16.99±3.34 18.37±2.34 B組 199.06±41.86▲ 192.15±28.84▲ 42.91±5.98▲ 32.57±4.50▲C組 304.63±30.33▲★ 230.05±39.20▲★ 37.00±7.12▲★ 41.23±5.61▲★D組 326.25±24.29▲★■ 246.76±28.89▲★■ 32.34±6.03▲★■ 46.79±8.20▲★■E組 366.87±26.28▲★■◆ 278.25±38.65▲★■◆ 25.70±3.34▲★■◆ 51.97±6.81▲★■◆

2.3 白藜蘆醇對NF-κB、MAPKs信號通路的影響 按照實驗分組提取組織蛋白，運用Western blot檢測NF-κB、MAPKs信號通路蛋白的表達發(fā)現(xiàn)，對于NF-κB 通路，B組相對于A 組NF-κB 磷酸化表達明顯上調，給予白藜蘆醇處理后表達有所抑制，且呈劑量依賴性。對于MAPKs通路，在高脂飲食成模后MAPKs信號通路（包括ERK1／2、JNK 和p38MAPK）磷酸化明顯上調，而在給予不同劑量白藜蘆醇治療后JNK 和p38 MAPK 的蛋白磷酸化水平得到不同程度的抑制，并呈劑量依賴性，見圖1。

圖1 白藜蘆醇對MAPKs和NF-κB信號通路蛋白磷酸化的影響

3 討 論

對于AS的形成與發(fā)展的研究表明，氧化應激與炎性反應是AS發(fā)生、發(fā)展的兩個關鍵環(huán)節(jié)，氧化應激引起血管內膜損傷，引起局部炎性反應，進一步發(fā)展為AS。

對于氧化應激，唐玉涵等［5］、朱立賢等［6］通過構建大鼠高脂血癥模型證實，高脂血癥可加強脂質過氧化作用，使MDA生成增加，SOD 活力降低，白藜蘆醇可以抑制高脂血癥大鼠的MDA 升 高 及SOD、GSH-PX、CAT 的 下 降。Shen 等［7］也 提出，白藜蘆醇可以抑制大鼠缺血再灌注心肌MDA 的產(chǎn)生，提高SOD 的活力，增加缺血心肌的存活率。本研究證實，在高脂飲食致AS兔模型中白藜蘆醇也可以降低MDA 的水平，升高SOD、CAT 等抗氧化酶的活力，從而發(fā)揮其抗氧化及心血管保護作用。

此外，有研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可通過增加血管平滑肌細胞內還原型GSH 的水平，降低細胞內氧化劑水平，從而保護細胞免受氧化損傷［8］。也有研究提示，GSH 的慢性缺乏會加劇負荷性心臟病的心室重構和心力衰竭［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，AS兔血中GSH 水平升高，GSH-PX 活力降低，GST、γ-GCS等的活力增加，給予白藜蘆醇后可觀察到GSH 的水平進一步增加，GSH-PX的活力也有所提升，GST、γ-GCS的活力則相對降低。GSH-PX、GST、γ-GCS作為合成GSH 的關鍵因子，其活力的變化提示白藜蘆醇可能通過影響GSH 的合成來發(fā)揮其抗氧化作用。

平滑肌細胞中的活性氧（ROS）可激活MAPKs信號通路，引起細胞增殖，還可激活NF-κB 信號通路，引發(fā)局部炎性反應，促進AS的發(fā)生［10-11］。白藜蘆醇可能通過抑制MAPKs信號通路來阻礙血管平滑肌細胞的增殖，從而發(fā)揮其抗AS 作用，還可以通過抑制NF-κB 信號通路的激活，抑制炎性反應，進而抗AS［12］。除外這些作用，還有研究表明外界刺激可激活ERK1／2、p38MAPK，活化的ERK1／2、p38MAPK 可使轉錄因子cfoscjun磷酸化，從而在轉錄水平調控γ-GCS mRNA 表達，使細胞質翻譯合成γ-GCS增加，GSH 的合成作用增強［13］。有研究發(fā)現(xiàn)，ERK 通路可以被CAT 所抑制，而抗氧化劑CAT 可以減少NF-κB的激活［14-15］。本實驗觀察到，高脂飲食可以激活MAPKs和NF-κB 信號通路，表現(xiàn)為ERK1／2、p38MAPK、JNK、NF-κB信號蛋白的磷酸化水平增加，給予不同劑量的白藜蘆醇干預后發(fā)現(xiàn)，ERK1／2、p38MAPK、JNK、NF-κB 信號蛋白的磷酸化水平得到不同程度的抑制，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。

綜上所述，筆者認為白藜蘆醇抗AS的作用可能是通過減低血脂水平，提高抗氧化酶活力，降低氧化應激，進而抑制MAPKs和NF-κB信號通路的激活來實現(xiàn)的。

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