miR-424慢病毒表達載體的構建及其對宮頸癌細胞增殖的影響＊

李 清，楊宇馨，戴 楠，代曉燕，任 濤，王 東，卿 毅

（第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所腫瘤中心，重慶400042）

miRNA 是一類由19～24個堿基組成的小分子非編碼調控的內源性單鏈RNA，與mRNA 的3′非翻譯區結合，以降解mRNA 或抑制其翻譯，從而在轉錄后水平負性調節靶mRNA的表達［1］。miRNA 廣泛存在于各種生物體內，對細胞周期調節、生長、發育、凋亡等過程發揮重要的作用；不僅影響了生物體的生長發育，并與多種人類疾病的發生密切相關［2］。目前已鑒定的人類miRNA 有數千種，調控數千種靶mRNA。近年來一些研究證實，某些miRNA 參與腫瘤的發生、發展過程，具有抑癌基因或者癌基因的功能［3-4］。同時，與越來越復雜的蛋白網絡相比，miRNA 作為一種新的強有力的工具，在腫瘤診斷、療效預測和治療靶點確定等研究中更具有獨特優勢。早期的研究表明，miR-424 可以作為一個潛在的腫瘤抑制基因表達譜［5-7］。例如，1項研究表明miR-424表達的異常下降，伴隨著對慢性淋巴細胞的致癌基因PLAG1強有力的抑制［8］。然而，有報道指出在EB病毒感染有關的B細胞淋巴瘤、舌鱗狀細胞癌與結腸癌中miR-424 表達卻增高［9-11］。經一些研究發現，miR-424在宮頸癌組織中也呈特異性低表達，同時在宮頸癌放療耐受細胞株中顯著下調。本研究旨在構建miR-424慢病毒質粒載體，并初步探索miR-424對宮頸癌Hela細胞增殖情況的調控，為下一步探討miR-424在宮頸癌放療抵抗中的作用機制及建立穩定高效的Hela細胞株打好基礎。

表1 引物序列

1 材料與方法

1.1 材料 人宮頸癌細胞株Hela、293T 細胞、DH5α、慢病毒表達載體pMD18T、輔助包裝載體pMD2.G、pSPAX2（本實驗室保存）；DMEM 培養基購自Gibco公司；胎牛血清、膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自Omega公司；限制性內切酶購自New England公司；DNA 連接酶購自Promega公司；DNA 聚合酶、T 載 體 試 劑 盒、SYBR premix Ex Taq Ⅱ、DNA marker（500～12 000）均購自Takara公司；TRIzol來源于Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 引物序列 所用引物由Invitrogen公司設計合成，根據miR Base數據庫獲得miR-424基因的前體序列，應用Primer 5.0軟件設計合成引物（引物的上下游分別含有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點），見表1。以人基因組DNA 為模板擴增，反應程序：98 ℃2min，98℃10s，58℃20s，72℃30s，30個循環。對擴增產物回收，將其與pMD18T 載體連接，進行測序。PCR 擴增pMD18T-miR424，載體質粒為pLentis-CMV-GFPMCS-PGK-PURO，37 ℃酶切擴增產物和載體質粒。酶切產物連接體系：酶切回收載體DNA 2μL、酶切PCR 產物2μL、DNA 連接酶緩沖液1μL、DNA 連接酶0.5μL、dd H2O 4.5 μL，16 ℃連接過夜，轉化細菌。挑取陽性克隆，使用Omega公司質粒提取試劑盒提取質粒，37℃酶切4h，經1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，鑒定正確的克隆進行下一步實驗。

1.2.2 慢病毒載體的包裝與感染 轉染前24h，用胰酶消化對數期生長的293T 細胞，計數后將密度5×105細胞鋪入6孔培養板中，培養體積為2 mL，37 ℃、5% CO2培養箱內培養。24h后觀察細胞狀態，若狀態良好，則進行轉染。在培養板中加入氯喹至終濃度25μmol／L，取1只試管，加入滅菌水及以下質粒（pMD2.G 1.5μg，pSPAX2 4.5μg，pLentis-CMV-GFPMCS-PGK-PURO 或pLentis-CMV-GFP-miR424-PGK-PURO 6.0μg），總體積為328.5μL，然后加入2 mol／L CaCl246.5 μL，混勻，最后再加入375μL 2×HBS，邊滴加邊振蕩，滴加完畢后，盡快將混合物加入到細胞培養皿中，輕輕搖晃混勻。轉染12h后換為新鮮培養基2mL，48h后觀察細胞狀態并收集上清液，500g離心10min，然后將上清液用0.45μm 濾器過濾，-70 ℃保存。用病毒液轉染293T 細胞，50μL 感染72h，確認病毒成功構建，取構建成功的病毒液感染Hela細胞。

1.2.3 運用RT-PCR檢測慢病毒感染宮頸癌細胞后miR-424的表達 用包裝獲得的慢病毒液感染宮頸癌Hela細胞，24h后換為新鮮培養基，擴大培養至6 孔板，用熒光顯微鏡觀察GFP的表達；當感染率超過50%時，可用適宜濃度的puromycin進行篩選。感染5d后，選擇3～5個孔用熒光顯微鏡觀察表達GFP的細胞的平均數，再用其平均數與總細胞的平均數的比值，估計出慢病毒的轉染效率。收集細胞，采用RT-PCR檢測miR-424的表達，反應 程 序：95 ℃20s，95 ℃10s，60 ℃20s，70 ℃10s，40個循環。實驗數據采用2-△△Ct方法計算，上述實驗重復4次。

1.2.4 MTT 檢測各細胞株增殖結果 調整細胞懸液密度為1×104個／mL，將細胞懸液加入到96孔板，每孔加200μL，細胞株在1塊96孔板上接種5孔，另外設置1個孔作為對照，共需接種6塊板。對接種的細胞常規培養，每隔2d換1次液，每日在固定時間處理一塊培養板，每孔加入MTT 20μL，37℃孵育4h后，每孔加入150μL 二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 min，再用酶聯免疫儀選擇490nm 對吸光度（A）值進行測定，最后取5個孔平均值，制作增殖曲線。

1.3 統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件進行分析，組間兩樣本均數比較采用t檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 miR-424的擴增 以人基因組作模板，使用Takara公司的Extaq聚合酶進行擴增反應，DNA 測序證明擴增片段的序列與miRBase數據庫獲得miR-424基因的前體序列完全一致（序列未列出）。

圖1 構建的載體中的酶切位點

2.2 重組慢病毒質粒載體的酶切測序鑒定 選取酶切鑒定正確的克隆pLentis-CMV-GFP-miR424-PGK-PURO重組質粒的陽性克隆的PCR 產物，1%瓊脂糖凝膠電泳，經測序證實Clone2序列正確，構建的載體中有3 個PstⅠ的酶切位點，分別位于6 457bp、1 168bp、915bp，見圖1。

圖2 質粒對細胞的轉染效率

圖3 293T 細胞轉染后miR-424的表達水平

圖4 慢病毒上清液對宮頸癌Hela細胞的轉染效率

圖5 Hela細胞轉染后miR-424的表達水平

2.3 質粒對293T 細胞的轉染效率 鑒定構建的質粒pLentis-CMV-GFP-miR424-PGK-PURO對293T 細胞的轉染效率，轉染效率在90%以上（圖2）；以2-△△Ct分析法計算，轉染48h后miR-424的表達量提高了45倍，見圖3。

2.4 miR-424慢病毒上清液對宮頸癌Hela細胞的轉染效率 鑒定構建的慢病毒上清液對宮頸癌Hela細胞的轉染效率，轉染效率在90%以上（圖4）；以2-△△Ct分析法計算，病毒感染后miR-424的表達量上調近60倍，見圖5。

2.5 MTT 檢測Hela細胞的增殖結果 采用miR-424慢病毒上清液轉染的宮頸癌Hela細胞，MTT 法檢測增殖結果提示感染miR-424慢病毒的宮頸癌Hela細胞株均存在細胞增殖明顯減慢，見圖6。

圖6 MTT 檢測Hela細胞的增殖結果

3 討 論

宮頸癌是嚴重危害我國婦女健康的惡性腫瘤之一，目前每年新增宮頸癌病例130 000余例、死亡50 000余例，其發病率與病死率分別占我國婦科腫瘤的第一、第二位［12］。在基因調控網絡中，miRNA 作為其調控的關鍵成分，通過調控基因的表達，miRNA 廣泛參與到對細胞死亡、分化、增殖及個體的發育等各種生命活動過程的調控。

Ghosh 等［13］研究也表明，在缺氧狀態下，冠狀動脈內皮細胞中miR-424表達升高，抑制Cullin-2蛋白表達，降低E3連接酶的合成，增加HIF-1α／HIF-2α在內皮細胞的表達，增強內皮細胞的增殖和遷移能力，在心肌缺血、缺氧后改善血供重構和促進血管新生中發揮重要作用。近年一些研究也證實，miRNA 參與腫瘤的發生、發展。Chow 等［14］發現，miR-424在腎透明細胞癌中的表達遠高于腎乳頭狀細胞癌。Wang等［15］在對宮頸癌miRNA 表達譜的研究中發現miR-424 在宮頸癌及CIN 組織中呈低表達。Emmanue Labourier將miR-424 低表達作為診斷宮頸癌或CIN 的指標之一，并運用在其研發的用于宮頸癌的特異性miRNA 芯片中，因此miR-424可能是宮頸癌特異性miRNA 標簽。miR-424可能通過下游某個靶基因，如CDC25A（細胞周期調控相關的基因）等來抑制宮頸癌細胞增殖［16］。Xu等［17］研究發現，恢復miR-424的表達將顯著影響宮頸癌細胞生物學行為，包括抑制擴散，增強細胞凋亡。

本研究構建了pLentis-CMV-GFP-miR424-PGK-PURO慢病毒載體，并用含慢病毒的上清液感染宮頸癌Hela細胞，成功抑制了宮頸癌Hela細胞的增殖。然而在miRNA 與腫瘤關系方面的研究，還需解決很多關鍵問題。miRNA 的加工過程復雜有序并且受多種因素精密調控。盡管當前已初步明確了miRNA 的加工過程中的某些重要步驟，但其中一些具體的調控因素、調控通路尚未研究清楚［18］。因此，還需在以后的研究中繼續探索。

綜上所述，本實驗采用分子克隆技術成功構建了miR-424的慢病毒載體，并構建了基于宮頸癌Hela細胞的高效轉染系統，并證實了被miR-424慢病毒感染后的宮頸癌Hela細胞株表現出增殖抑制，為下一步研究miR-424在宮頸癌中的作用靶點以及對其進行功能研究和體外實驗奠定了基礎。

［1］ Esquela-Kerscher A，Slack FJ.Oncomirs-microRNAs with a role in cance［J］.Nat Rev Cancer，2006，6（4）：259-269.

［2］ Ambros V.The functions of animal microRNAs［J］.Nature，2004，431（7006）：350-355.

［3］ Lee JW，Choi CH，Bae DS，et al.Altered MicroRNA expression in cervical carcinomas［J］.Clin Cancer Res，2008，14（9）：2535-2542.

［4］ Fassan M，Baffa R，Palazzo JP，et al.MicroRNA expression profiling of male breast cancer［J］.Breast Cancer Res，2009，11（4）：R58.

［5］ Liu Q，Fu H，Sun F，et al.miR-16family induces cell cycle arrest by regulating multiple cell cycle genes［J］.Nucleic Acids Res，2008，36（16）：5391-5404.

［6］ Forrest AR，Kanamori-Katayama M，Tomaru Y，et al.Induction of microRNAs，mir-155，mir-222，mir-424 and mir-503，promotes monocytic differentiation through combinatorial regulation［J］.Leukemia，2010，24（2）：460-466.

［7］ Kawahigashi Y，Mishima T，Mizuguchi Y，et al.MicroRNA profiling of human intrahepatic cholangiocarcinoma cell lines［J］.J Nippon Med Sc，2009，76（4）：188-197.

［8］ Pallasch CP，Patz M，Claus R et al.miRNA deregulation by epigenetic silencing disrupts suppression of the oncogene PLAG1in chronic lymphocytic leukemia［J］.Blood，2009，114（15）：3255-3264.

［9］ Imig J，Motsch N，Zhu JY，et al.microRNA profiling in Epstein-Barr virus-associated B-cell lymphoma［J］.Nucleic Acids Res，2011，39（5）：1880-1893.

［10］ Rentoft M，Fahlen J，Coates PJ，et al.miRNA analysis of formalin-fixed squamous cell carcinomas of the tongue is affected by age of the samples［J］.Int J Oncol，2011，38（1）：61-69.

［11］ Wang YX，Zhang XY，Zhang BF，et al.Initial study of microRNA expression profiles of colonic cancer without lymph node metastasis［J］.J Dig Dis，2010，11（1）：50-54.

［12］ 卿毅.放射線抵抗宮頸癌細胞株DNA 損傷修復基因表達譜的研究［D］.重慶：第三軍醫大學，2009.

［13］ Ghosh G，Subramanian IV，Adhikari N，et al.Hypoxia-induced microRNA-424 expression in human endothelial cells regulates HIF-alpha isoforms and promotes angiogenesis［J］.J Clin Invest，2010，120（11）：4141-4154.

［14］ Chow TF，Mankaruos M，Scorilas A，et al.The miR-17-92 cluster is over expressed in and has an oncogenic effect on renal cell carcinoma［J］.J Urol，2010，183（2）：743-751.

［15］ Wang X，Tang S，Le SY et al.Aberrant expression of oncogenic and tumor-suppressive microRNAs in cervical cancer is required for cancer cell growth［J］.PLoS One，2008，3（7）：e2557.

［16］ Sarkar S，Dey BK，Dutta A.MiR-322／424and-503are induced during muscle differentiation and promote cell cycle quiescence and differentiation by down-regulation of Cdc25A［J］.Mol Biol Cell，2010，21（13）：2138-2149.

［17］ Xu J，Li Y，Wang F，et al.Suppressed miR-424expression via upregulation of target gene Chk1contributes to the progression of cervical cancer［J］.Oncogene，2013，32（8）：976-987.

［18］ 劉梅，賀平，羅志華，等.MiRNA 與腫瘤［J］.西部醫學，2012，24（5）：1022-1024.