CXC趨化因子配體16在慢性腎臟病中的表達及其意義

葉菡洋，金領微，金建，陳琰，高依依，黃文，李占園，鄭育，周志宏

（溫州醫科大學附屬第二醫院 腎內科，浙江 溫州 325027）

·論 著·

CXC趨化因子配體16在慢性腎臟病中的表達及其意義

葉菡洋，金領微，金建，陳琰，高依依，黃文，李占園，鄭育，周志宏

（溫州醫科大學附屬第二醫院 腎內科，浙江 溫州 325027）

目的：觀察CXC趨化因子配體16（CXCL16）在慢性腎臟病（CKD）患者和CDK動物模型中的表達情況，研究其與腎功能等因素的相關性，探討CXCL16在CKD進展中的作用。方法：在臨床研究方面，收集200例CKD患者[按腎小球濾過率（eGFR）分為CKD 1-2期組、CKD 3-4期組和CKD 5期組]和40例健康對照組的外周血標本，檢測血清肌酐、尿素氮、血脂、eGFR等各項指標，并檢測血清中CXCL16的含量。在動物實驗方面，取雄性C57BL/6小鼠14只，隨機分為普通對照組及普通模型組（各7只），雄性CXCL16基因敲除小鼠7只，隨機分為基因敲除對照組（3只）及基因敲除模型組（4只）。4周后處死小鼠，檢測小鼠血清尿素氮、肌酐、CXCL16等指標，觀察腎組織病理改變。結果：健康對照組和CKD各期組患者之間年齡、性別、體質量指數（BMI）差異無統計學意義（P＞0.05）。CKD 5期組患者血清CXCL16水平高于健康對照組和CKD 1-2期組、CKD 3-4期組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。在校正了CKD患者的年齡、性別、BMI后，eGFR、C-反應蛋白（CRP）和脂聯素與血漿CXCL-16獨立相關。在動物實驗中，CXCL基因敲除模型組與普通模型組相比，其血清尿素氮、肌酐及尿酸升高幅度偏低；腎臟病理提示基因敲除模型組小鼠腎臟損傷程度輕于普通模型組。結論：隨著CKD的進展，血漿中CXCL-16的水平顯著升高，并與腎功能的變化獨立相關。

CXC趨化因子配體16；腎疾病，慢性；腎功能不全

CXC趨化因子配體16（CXCL16）是一個跨膜分子，因其具有受體的功能而被命名為磷脂酰絲氨酸和氧化脂蛋白（ox-LDL）的清道夫受體，參與炎癥和免疫應答過程。作為清道夫受體，CXCL16可以介導巨噬細胞吞噬ox-LDL，形成泡沫細胞，促進動脈粥樣硬化的發生。作為趨化因子，它可以參與炎癥細胞的趨化及炎癥細胞間的相互作用。已有研究證實CXCL16在腎臟組織中有表達，但迄今為止對CXCL16的確切生物活性及其作用機制仍了解甚少。本研究通過觀察慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）患者外周血中CXCL16的表達差異，并構建CKD動物模型，觀察在CXCL16基因敲除后其腎臟功能和病理改變，初步探討CXCL16在CKD中的意義。

1 對象和方法

1.1 臨床研究部分

1.1.1 對象：選取2012年1月至2012年12月在溫州醫科大學附屬第二醫院腎內科就診的CKD患者共200例，其中女71例，男129例。腎小球濾過率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）根據簡化的腎臟病飲食公式（the simplified modification of diet in renal disease formula，MDRD公式）估算，eGFR=175×[肌酐（mg/dL）]-1.234×[年齡（歲）]-0.179×性別（男性=1，女性=0.79）。按照《慢性腎臟病及透析的臨床實踐指南》（簡稱為K/DOQI指南）中CKD診斷標準將患者分為CKD 1-2期組、CKD 3-4期組和CKD 5期組。選取我院同期體檢的健康成人40例為對照組，其中男26例，女14例，其血常規、尿常規、肝腎功能、血電解質和血脂等均處正常范圍。所有受試對象均簽署知情同意書。

1.1.2方法：①收集一般資料，如年齡、性別、體質量指數（BMI）以及既往病史。②空腹至少10 h后，取2.5 mL外周血標本分離血清，按0.2 mL等分分裝，-80 ℃低溫保存。取分離的血樣品一份送本院臨床檢驗室，日立7600全自動儀進行各項生化指標檢測，以化學試劑法測定。檢測指標包括：白蛋白、空腹血糖、血磷、尿素氮、肌酐、尿酸、總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白等。③采用酶聯免疫吸附（ELISA）法測定血清CXCL16、脂聯素、C-反應蛋白（C-reactive protein，CRP），檢測試劑盒均購于美國R&D公司，操作步驟按試劑盒說明書進行。

1.2 動物實驗部分

1.2.1 動物：清潔級雄性10周齡C57BL/6小鼠14只，體質量22～24 g，購自北京唯通利華實驗動物技術有限公司（動物合格證號：0300740），適應性喂養1周后，隨機分為普通對照組和普通模型組，各7只。10周齡雄性CXCL16基因敲除C57BL/6小鼠7只，體質量15～17 g，由溫州醫科大學藥學院贈送，適應性喂養1周后，隨機分為基因敲除模型組（n=4）和基因敲除對照組（n=3）。所有動物均飼養于溫州醫科大學實驗動物中心，溫度為（23±2）℃，相對濕度為（55±2）%，房間保持通風、安靜，定期更換墊料，清洗籠具。參考Yokozawa等[1]實驗方法，普通模型組和基因敲除模型組予腺嘌呤混懸液灌胃（第1周和第2～第4周給藥劑量分別為250 mg/kg和125 mg/kg，均為每2 d給藥1次，上午給藥）。普通對照組、基因敲除對照組予等量蒸餾水灌胃。

1.2.2 方法：①觀察小鼠給藥期間的身體狀況及活動情況，每天記錄攝食量及體質量變化。②造模4周后處死小鼠，摘除小鼠眼球取血，血標本室溫下2 000 r/min離心10 min，然后取上層血清，用日立7600全自動儀以化學試劑法測定其中CXCL16、尿素氮、肌酐、尿酸等指標的含量。③造模4周后解剖小鼠并取出雙側腎臟，經10%甲醛固定、石蠟包埋，切片厚度為3μm，采用HE染色法觀察腎組織病理變化。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS13.0進行統計學處理。計量資料采用表示，組間比較根據數據是否正態分布及各組間是否方差齊性分別選用單因素方差分析和非參數檢驗。率的比較采用卡方檢驗。相關分析采用pearson相關和逐步回歸法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床研究結果

2.1.1 臨床資料比較：對照組和CKD各期患者之間年齡、性別差異無統計學意義（P＞0.05）。CKD各期甘油三酯和血尿酸水平均高于對照組（P＜0.05），血漿白蛋白低于對照組，而CKD各期之間差異無統計學意義（P＞0.05）。CKD 1-4期患者與對照組比較，空腹血糖、脂聯素差異均無統計學意義（P＞0.05），CKD各期組血CRP、肌酐、尿素氮明顯高于對照組（P＜0.05），且CKD各期之間CRP、肌酐、尿素氮差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組患者一般資料和生化指標的比較（±s）

2.1.2 各組患者血清CXCL16水平的比較：本研究顯示男性[（2.20±0.41）ng/mL，n=155]與女性[（2.18±0.53）ng/mL，n=85]之間血清CXCL16水平差異無統計學意義（P=0.93）。CKD 5期組患者血清CXCL16水平顯著高于對照組，并高于CKD 1-2期組及CKD 3-4期組，差異均有統計學意義（P＜0.05），且隨著CKD進展，CXCL16水平逐步增加（見表1）。伴2型糖尿病CKD患者（n=68）的血清CXCL16水平為（2.28±0.63）ng/mL，非糖尿病CKD患者（n=132）的血清CXCL16水平為（2.08±0.58）ng/mL，兩者間差異有統計學意義（P=0.023）。伴高血壓CKD患者（n=92）的血清CXCL16水平為（2.23±0.66）ng/mL，非高血壓CKD患者（n=108）的血清CXCL16水平為（2.10±0.63）ng/mL，兩者間差異無統計學意義（P=0.138）。血清CXCL16水平在伴冠心病的CKD患者和非冠心病的CKD患者間差異亦無統計學意義（P=0.396）。但是，同時有糖尿病、高血壓和冠心病的CKD患者（n=9）血清CXCL16水平為（2.47±0.63）ng/mL，與沒有這些伴發病的CKD患者[（2.01±0.36）ng/mL，n=55]相比明顯升高（P=0.005）。

2.1.3 血清CXCL16與各臨床參數間的相關性：通過年齡、性別、BMI、高血壓和糖尿病的校正后，相關分析顯示血清CXCL16水平與血尿素氮、肌酐、尿酸、脂聯素、CRP呈正相關（分別r=0.255、0.288、0.167、0.375、0.149），與eGFR、高密度脂蛋白呈負相關（分別r=-0.255、-0.172），詳見表2。

2.1.4 逐步回歸分析 結果：在校正了CKD患者的年齡、性別、BMI后，eGFR、CRP和脂聯素與血漿CXCL16獨立相關（分別P=0.003，P＜0.001，P=0.033，見表3），而其他參數在分析后均排除了這種相關性。

2.2 動物實驗結果

2.2.1 小鼠體質量及血生化指標變化：在實驗中我們觀察到在同一時間點，相較于普通對照組和基因敲除對照組，普通模型組和基因敲除模型組小鼠稍萎靡，體質量下降，活動量減少；普通模型組及基因敲除模型組小鼠血尿素氮、肌酐及磷較普通對照組明顯升高，提示本實驗造模成功。基因敲除模型組與普通模型組相比，其血清尿素氮、肌酐及磷升高幅度偏低（見表4）。

2.2.2 各組小鼠CXCL16的表達：與普通對照組相比，普通模型組小鼠的血標本中CXCL16表達明顯升高，而在基因敲除模型組及基因敲除對照組中，CXCL16的表達幾乎檢測不到，見表4。

表2 血漿CXCL16水平與各項指標的相關性

表3 逐步回歸分析血漿CXCL16水平與各項指標的獨立相關性

2.2.3 各組小鼠腎臟病理光鏡下改變：HE染色結果顯示，模型組部分腎小球系膜區細胞增生，基質增多，部分腎小管上皮細胞腫脹、空泡變性，腎間質有炎性細胞浸潤。基因敲除模型組小鼠腎臟損傷程度比較普通模型組輕（見圖1）。

3 討論

CXCL16是一種表達于樹枝狀細胞和巨噬細胞的趨化因子，它對T細胞和NK細胞進入各種組織和細胞間的相互作用（通過CXCR-6反受體）起著重要的作用[2]。國內外研究提示CXCL16在動脈粥樣硬化、類風濕性關節炎、心瓣膜病、炎性肝病、腫瘤等疾病進展中發揮作用。目前對CXCL16與腎臟疾病關系的研究主要集中在動物水平，在人體尤其是CKD患者中，有關CXCL16的研究尚少。國外學者通過雙色免疫熒光法證實了CXCL16和金屬蛋白酶ADAM10在正常人群和腎炎患者的腎組織中均有表達，以腎小球、遠曲小管、連接管、集合管的主細胞等部位為主[3]。有研究提示血清CXCL16水平在伴腎病活動性系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）患者中明顯高于非腎病活動性SLE患者，并且在狼瘡鼠模型的受累腎臟中發現CXCL16的高度表達[4]。也有研究發現，痛風患者CXCL16的表達與腎功能密切相關，在痛風合并CKD患者中，其血漿CXCL16水平顯著高于正常對照人群以及單純CKD患者[5]。

表4 各組小鼠血生化指標變化（±s）

表4 各組小鼠血生化指標變化（±s）

組別nCXCL16（pg/mL）白蛋白（g/L）尿素氮（mmol/L）肌酐（μmol/L）磷（mmol/L）普通對照組7194.42±49.9014.1±0.913.4±0.522.6±3.52.42±0.2普通模型組7362.80±72.23a12.6±0.5a19.4±1.1a39.6±2.4a3.60±1.2a基因敲除模型組418.50±2.38ab14.0±0.8b17.0±0.8ab30.5±0.6ab3.00±0.2ab基因敲除對照組319.60±1.52ab14.0±1.0b13.0±1.0bc23.6±1.5bc2.30±0.2bcF 50.635.6767.3558.7960.26與普通對照組比：aP＜0.05；與普通模型組比：bP＜0.05；與基因敲除模型組比：cP＜0.05

本組資料顯示隨著CKD患者的腎功能下降，從早期進展到終末期，血漿CXCL16濃度進行性增高，且CKD患者的CXCL16濃度明顯高于健康人群，此結果提示CXCL16在腎病的進展中扮演重要的角色。eGFR、血肌酐和血尿素氮是反映腎功能變化的常用指標，我們的研究提示在所有的CKD患者中，血漿CXCL16的水平與eGFR、肌酐和尿素氮密切相關，這也提示CXCL16與CKD患者的腎功能改變密切相關。但是，目前CXCL16濃度增高與CKD進展相關的具體機制尚未完全清楚。既往動物實驗顯示單側輸尿管梗阻后，高膽固醇血癥和高ox-LDL的產生可引起腎功能損傷，其血漿中CXCL16隨腎功能損傷顯著增高，而且在腎小球疾病尤其膜性腎病的病理中，CXCL16作為ox-LDL的清道夫受體表達于足細胞[6-7]。我們推測CXCL16隨CKD患者疾病進展而增高是由于代謝應激所致，具體機制需要進一步研究。

同時我們的研究顯示，在合并有糖尿病的CKD患者的血漿CXCL16水平顯著高于非糖尿病CKD患者，血漿CXCL16水平與eGFR、CRP和脂聯素水平呈獨立正相關，證實了CXCL16在機體炎癥介導方面起了積極的作用。

目前CXCL16在CKD患者體內表達增加的意義尚未明確。CXCL16的升高是抵抗腎功能惡化的一種適應性反應，還是在腎功能惡化過程中起著推動作用，是我們接下去要解答的問題。所以我們在實驗研究中建立了CKD動物模型，觀察CXCL16基因敲除小鼠與普通小鼠的腎臟損害情況。研究發現在普通小鼠CKD模型中，其血漿CXCL16的表達明顯增加，同時小鼠出現了明顯的腎功能損害及腎臟病理損傷，而在CXCL16基因敲除小鼠的慢性腎病模型中，血漿中的CXCL16幾乎未檢測到，且腎功能損害及腎臟病理損傷輕于小鼠造模組。因此，我們推測CXCL16在腎臟病變中可能為損傷因子，其高濃度的表達促進腎單位損傷加重。Xia等[8]在CXCL16基因敲除小鼠的研究中發現，CXCL16的炎癥趨化作用在腎臟損傷和腎臟纖維化中起到了重要作用。

綜上所述，我們的研究結果顯示隨著腎功能的惡化，CXCL16水平逐漸升高，而CXCL16的高表達可進一步促進腎單位損傷。對CXCL16活性和腎功能下降的病因機制的進一步研究可能為治療終末期CKD患者提供新的目標。

[1] Yokozawa T, Zheng PD, Oura H, et al. Animal model of adenine-induced chronic renal failure in rats[J]. Nephron, 1986, 44(3): 230-234.

[2] Norlander AE, Saleh MA, Modhur MS, et al. A chemokinecausing chronic kidney disease[J]. Hypertension, 2013, 62: 1008-1010.

[3] Gutwein P, Abdel-Bakky MS, Schramme A, et al. CXCL16 is expressed in podocytes and acts as a scavenger receptor for oxidized low-density lipoprotein[J]. Am J Pathol, 2009, 174(6): 2061-2072.

[4] Wu T, Xie C, Wang HW, et al. Elevated urinary VCAM-1, P-selectin, soluble TNF receptor-1, and CXC chemokine ligand 16 in multiple murine lupus strains and human lupus nephritis[J]. J Immunol, 2007, 179(10): 7166-7175.

[5] 吳帆, 龔琦, 俞佳文, 等. 痛風患者CXCL16血清水平的變化及臨床意義[J]. 中國病理生理雜志, 2011, 27(10): 1977-1981.

[6] Okamura DM, Lopez-Guisa JM, Koelsch K, et al. Atherogenic scavenger receptor modulation in the tubulointerstitium in response to chronic renal injury[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2007, 293(2): F575-F585.

[7] Schramme A, Abdel-Bakky MS, Gutwein P, et al. Characterization of CXCL16 and ADAM10 in the normal and transplanted kidney[J]. Kidney Int, 2008, 74(3): 328-338.

[8] Xia Y, Entman ML, Wang Y, et al. Critical role of CXCL16 in hypertensive kidney injury and fbrosis[J]. Hypertension, 2013, 62(6): 1129-1137.

（本文編輯：丁敏嬌）

Objective:To study the effect of C-X-C chemokine ligand 16 (CXCL16) in patients with chronic kidney disease (CKD) and animal models of nephritic syndrome. To investigate whether elevated CXCL16 concentrations were associated with renal failure in the development of CKD.Methods:Serum samples of 40 healthy people and 200 CKD subjects including our patients and long-term hemodialytic patients were collected. Plasma CXCL16 levels and other clinical and biochemical parameters in all subjects were obtained based on the clinical examinational standard methods. As for experimental animals, 14 male C57BL/6 rats were obtained, which were distributed into common control group and common model group. 7 CXCL16 knockout rats which were randomly distributed into knockout control group and knockout model group were also obtained. Their living conditions were observed for 4 weeks. After that, they were killed and their serum urea nitrogen, creatine, CXCL16 and other indexes were determined; the pathological changes of their kidney tissues were observed.Results:Plasma CXCL16 levels were signifcantly increased with the development of CKD from early-and endstage (P＜0.001 for trend), median circulating CXCL16 level was higher in end-stage CKD patients compared with the early-stage CKD patients and the middle-stage CKD patients. After adjusting for age, gender, and body mass index (BMI), plasma CXCL-16 levels signifcantly associated with renal function and other factors in CKD subjects. Correlative analysis showed the level of CXCL16 was positively associated with serum urea nitrogen, serum creatine, CRP and adiponectin (P＜0.05), and negatively associated with eGFR, HDL-C. In the animal experiments, compared with those in common model group, the increments of serum urea nitrogen, creatine and uric acid in knockout model group were much lower. Renal pathology indicated the level of kidney damage in knockout model group was lower than that in common model group. Conclusion: Plasma CXCL16 levels are signifcantly increased with the development of early-to end-stage CKD and are independently associated withthe loss of renal function. Understanding whether increased CXCL16 is a marker or a potential mechanism of myocardial hypertrophy in CKD requires further study.

CXCL16; kidney disease, chronic; renal failure

R692

A

1000-2138（2014）12-0887-05

2014-04-08

溫州市科技計劃項目（Y20100221）。

葉菡洋（1979-），女，浙江溫州人，主治醫師，碩士。

周志宏，主任醫師，Email：markzhou@wzhealth.com。

Expression and signifcance of CXCL-16 in chronic kidney disease

YE Hanyang, JIN Lingwei, JIN Jian, CHEN Yan, GAO Yiyi, HUANG Wen, LI Zhanyuan, ZHENG Yu, ZHOU Zhihong. Department of Nephrology, the Second Affliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027