VEGF經PI3K-Akt-Bad通路降低凍存后EOCs凋亡率

酈錚錚，林以諾，郭宴會

（溫州醫科大學附屬第一醫院，浙江 溫州 325015，1.神經內科；2.心內科）

·論 著·

VEGF經PI3K-Akt-Bad通路降低凍存后EOCs凋亡率

酈錚錚1，林以諾2，郭宴會2

（溫州醫科大學附屬第一醫院，浙江 溫州 325015，1.神經內科；2.心內科）

目的：探討血管內皮生長因子（VEGF）對低溫凍存內皮生長暈細胞（EOCs）凋亡率的影響及其與PI3K-Akt-Bad信號通路的關系，研究VEGF降低低溫凍存EOCs凋亡率的可能機制。方法：采用密度梯度離心法分離人臍帶血中的單個核細胞，經體外擴增培養EOCs，用免疫細胞化學染色及熒光染色法鑒定細胞的內皮特性。以擴增后的第二代細胞為生物材料，將其分為W組（wortmannin干預24 h后凍存）、W+V組（wortmannin干預24 h后+50μg/L VEGF凍存）、BC組（空白對照組）、V組（50μg/L VEGF凍存），于-80 ℃凍存24 h后復蘇。用流式細胞術檢測EOCs凋亡率，Western blot法檢測p-Akt、Bad、Caspase 3的表達量。結果：采用體外擴增培養的EOCs具有多種內皮細胞特性。低溫凍存會增加EOCs的凋亡率（為5.36%±0.27%），但50μg/L VEGF能夠降低低溫凍存和復蘇過程EOCs的凋亡率（為3.36%±0.27%，P＜0.05）；經wortmannin對PI3K特異性抑制后，VEGF對EOCs的保護作用減弱，細胞的凋亡率增加（為8.34%±0.57%，P＜0.05）；加50μg/L VEGF的EOCs凍存細胞p-Akt表達升高而Bad和Caspase 3表達降低（均P＜0.05），經wortmannin干預24 h后的EOCs凍存細胞p-Akt表達降低而Bad和Caspase 3表達升高（均P＜0.05）。結論：50μg/L VEGF能夠降低低溫凍存EOCs的凋亡率，其作用可能通過PI3K-Akt-Bad信號通路來實現。

血管內皮生長因子；內皮生長暈細胞；凍存；凋亡；信號通路

內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是能夠分化為血管內皮細胞的前體細胞。目前研究證明人體內至少存在兩種類型的內皮前體細胞，分別為早期EPCs及晚期EPCs，后者又稱為內皮生長暈細胞（endothelial outgrowth cells，EOCs）。它們不僅參與胚胎血管生成，還參與出生后血管新生過程，具有修復血管內皮和促進缺血組織血管新生的作用[1-2]。隨著內皮前體細胞與冠心病相關性研究的深入，以及TOPCARE-AMI試驗[3-4]和COMPARE-AMI試驗[5]對其長期安全性和可行性的證實，以內皮前體細胞為基礎的治療越來越擴寬著臨床醫師治療冠心病的思維，并可能成為冠心病干細胞移植治療心肌損傷的新興手段。

體外培養、凍存、適時復蘇EOCs能夠解決其數量低、培養周期長、不能及時有效進行細胞移植等難題。盡管Lin等[6]已經成功從凍存的人類臍帶血中分離培養出內皮前體細胞，但對臍帶血的凍存會導致臍帶血細胞的大量凋亡并降低內皮前體細胞的分化能力，且集落形成率也相應降低[7-8]。但是，對已分離培養的EOCs直接凍存也可能會導致細胞凋亡率增加，使EOCs的復蘇成功率降低。血管內皮生長因子（vascular endothelium growth factor，VEGF）是血管內皮細胞特異性促有絲分裂原，能夠高效、特異地促進血管EPCs的分裂、分化和增殖，增加血管通透性，有利于新生血管的形成[9]。因此VEGF也許可以對低溫凍存的EOCs起到保護作用。PI3K/Akt信號通路是目前已知重要的抗凋亡通路，本研究主要觀察VEGF能否提高凍存EOCs的存活率，以及對PI3K-Akt-Bad信號通路起到的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 D-Hank’s液、PBS、0.05%的胰酶、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自Gibico公司，EGM-2培養基購自Lonza公司，人纖維連接蛋白（human fibronectin，HFN）購自Chemicon公司，重組人VEGF165購自Reprotech公司，ABC免疫組織化學試劑盒和AEC染色試劑盒購自華美生物工程公司，Annexin V-碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡試劑盒及FITC標記荊豆凝集素I（FITC-UEA-I）購自Sigma公司，Dil標記的乙酰化LDL（DiL-ac-LDL）購自invitrogen公司，小鼠抗FLK-1單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）、兔抗CD34抗體及兔抗VIII抗體購自Santa Cruz公司，兔抗p-Akt、 Bad、Caspase 3多克隆抗體（polyclonal antibody，pcAb）購自Cell Signaling Technology公司，wortmannin購自Cayman Chemical公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞分離培養：自2012年1月至2012年9月期間收集棄用的新鮮健康臍帶血共8例（血標本來自本市某三甲醫院產科，30～40 mL），每位產婦均在分娩前簽署知情同意書。采用梯度離心法分離血中的單個核細胞并重懸于5 mL含10% FBS的EGM-2培養液中，均勻接種在預先包被有HFN的25 mL培養瓶中，置37 ℃細胞培養箱中24 h后吸棄全部培養液，用PBS液輕柔吹洗未貼壁細胞并更換5 mL EBM-2新鮮培養液，此后7 d內每24 h更換半液，7 d后每72 h更換全液，并觀察細胞生長情況，待細胞生長至80%后進行下一步操作。

1.2.2 細胞免疫組織化學染色法：第一代細胞消化后接種至蓋玻片上，培養至貼壁，采用4%的多聚甲醛固定20 min，0.3% H2O2-甲醛液封閉內源性過氧化物酶10 min，PBS沖洗后分別加1∶100稀釋的小鼠抗FLK-1抗體、兔抗VIII因子相關抗原抗體及兔抗CD34抗體，于4 ℃下孵育過夜，二抗結合參照ABC免疫組織化學檢測試劑盒說明書進行，之后用AEC染色試劑染色，蘇木素復染，于100倍倒置相差顯微鏡下觀察染色結果[10]。采用T/G人血管平滑肌細胞株作為陰性對照。

1.2.3 細胞熒光染色法：第一代細胞消化后接種至蓋玻片上，培養至貼壁，在上述細胞中加入DiI-ac-LDL（10 mg/L）37 ℃孵育4 h，4%多聚甲醛溶液固定10 min，PBS浸洗后將FITC-UEA-I（10 mg/L）加于上述標本37 ℃孵育l h。采用熒光顯微鏡觀察染色結果，DiI-ac-LDL和FlTC-UEA-I雙染色陽性細胞為正在分化的EPCs[10]。

1.2.4 實驗分組與細胞凍存：第一代EOCs經0.05%胰蛋白酶消化收集后分成4組：①W組：經1μmol/ L wortmannin干預24 h后凍存；②W+V組：經1 μmol/L wortmannin干預24 h后，再與含50μg/L VEGF的凍存液共同凍存；③BC組：直接凍存，空白對照；④V組：不經wortmannin干預，與含50μg/L VEGF的凍存液在-80 ℃低溫共同凍存24 h。凍存液以DMSO∶FBS∶EGM-2按照1∶2∶7的比例配成并預冷至4 ℃，上述各組細胞采用1 mL凍存液（含或不含50μg/L VEGF）重懸于凍存管中，置于4 ℃凍存4 h，-20 ℃凍存1 h，然后轉入-80 ℃凍存24 h。

1.2.5 流式細胞儀檢測凋亡率：各組細胞從-80 ℃凍存環境中取出后迅速置入37 ℃水浴箱中，待液體溶解后轉入9 mL含10% FBS的EGM-2培養液中，100 g離心力低速離心10 min，吸棄上清液后加入4 ℃預冷的PBS液5 mL洗滌一次，用100μL 1×Annexin-Blinding buffer重懸，然后每管加入Annexin V 5μL和100μg/mL PI 1μL，室溫下避光孵育15 min，加入400μL 1×Annexin-Binding buffer輕柔混勻，經流式細胞儀檢測。

1.2.6 Western blot法測定p-Akt、Bad、Caspase 3：凍存細胞復蘇后裂解并提取總蛋白，BCA法測定各組蛋白濃度。各組上樣30μg，行15% SDS-PAGE電泳、轉膜，5%脫脂牛奶室溫下封閉2 h后與抗p-Akt pcAb、抗Bad pcAb和抗Caspase 3 pcAb混合液4 ℃孵育過夜，TBS-T溶液洗膜3次。室溫下加入IgG抗體（1∶4 000）孵育1.5 h，洗膜3次，用Odyssey近紅外雙色激光成像系統選擇800通道進行條帶掃描，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內參照標化p-Akt、Bad、Caspase 3蛋白質表達，用AlphaEaseFC凝膠成像分析軟件進行半定量分析。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS 18.0軟件完成統計學分析。計量資料以表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，獨立的2組間比較用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EOCs的培養及鑒定 單個核細胞在培養第6～第9天可出現單個體積較大的EOC，見圖1a；此后細胞迅速增多形成集落，第11天細胞生長逐漸融合，見圖1b；第14天形成大型集落，見圖1c。培養的EOCs表面CD34、Flk-1、VIII因子相關抗原表達均為陽性，提示細胞有干細胞和內皮細胞特性，見圖2。所有細胞均能夠攝取DiI-ac-LDL（紅色熒光）并結合FITC-UEA-I（綠色熒光），雙熒光染色陽性提示細胞正在分化，見圖3。

2.2 各組EOCs凍存后凋亡率的差異 -80 ℃低溫凍存24 h復蘇后BC組細胞凋亡率為5.36%±0.27%；

圖1 EOCs的生長過程（×100）

圖2 EOCs的免疫組織化學染色（×100）

圖3 EOCs的雙熒光染色（×800）

圖4 流式細胞儀檢測凍存EOCs復蘇后早期凋亡率

2.3 Western blot法測定p-Akt、Bad、Caspase 3表達 V組與BC組、W組及W+V組相比，p-Akt表達量有升高，而Bad及Caspase 3的表達量降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）；W組、W+V組較BC組和V組的p-Akt的表達量降低，而Bad、Caspase 3表達量均有不同程度升高，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；W組Caspase 3表達水平高于W+V組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖5和表1。 V組細胞凋亡率為3.36%±0.27%，與BC組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；W+V組細胞凋亡率為8.34%±0.57%，與W組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；W組細胞凋亡率為12.12%±0.71%，與BC組比較差異有統計學意義（P＜0.05），見圖4。

圖5 Western Blot法檢測p-Akt、Bad、Caspase 3蛋白表達水平

表1 各組細胞p-Akt、Bad及Caspase 3經GAPDH校正后的灰度值（±s）

表1 各組細胞p-Akt、Bad及Caspase 3經GAPDH校正后的灰度值（±s）

組別p-AktBadCaspase 3 BC組0.27±0.030.18±0.040.67±0.08 V組0.46±0.06ab0.13±0.02ab0.50±0.08abW組0.22±0.01a0.24±0.04a0.94±0.12aW+V組0.24±0.02a0.23±0.02a0.80±0.13a與BC組比：aP＜0.05；與W組比：bP＜0.05

3 討論

內皮功能不完全貫穿于冠心病的發生、發展過程，內皮前體細胞在維持內皮功能的完整性方面發揮重要作用。早期EPC表達內皮細胞和造血干細胞標志，維持造血分化潛能和功能，通過自分泌或旁分泌VEGF、SDF-1、IL-8等細胞因子，促進損傷血管內皮和缺血組織的內皮修復和血管生長[11]。當將其注入缺血組織如視網膜后可迅速形成毛細血管網，而早期EPCs不具備這種功能[12]。一些小規模的骨髓單個核細胞移植治療心肌梗死、周圍肢體缺血、嚴重的冠心病以及心力衰竭的I期臨床試驗為內皮祖細胞移植療法提供了可行性和安全性的初步依據[3-5]。

EOCs分離培養周期較長，不利于及時進行細胞移植治療。因此直接分離培養的EOCs能否有效地凍存和完好地復蘇成為其在臨床應用中的一個關鍵問題。在研究中觀察到凍存的EOCs基礎凋亡水平為5.36%±0.27%，證實凍存不可避免地會對細胞造成一定程度的傷害[7]，因此需要尋找一種保護細胞抵抗低溫凍存傷害的介質。VEGF是血管內皮細胞特異性促有絲分裂原，能夠高效特異地促進血管EPCs的分裂、分化和增殖，還可抑制EPCs的凋亡[9]。本研究中可以觀察到50μg/L VEGF能使凍存的EOCs凋亡水平降低到3.36%±0.27%，因而它可能會成為一種較為理想的EOCs凍存保護介質。

PI3K-Akt信號通路是介導細胞存活的重要通路，依賴于血管內皮生長因子受體2（vascular endothelium growth factor receptor-2，VEGFR2）及其隨后激活的PI3K，活化的PI3K在細胞附近催化PIP2生成PIP3，隨后磷酸化激活蛋白激酶Akt，再磷酸化Bcl-2相關凋亡啟動子（Bad）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（Caspase 9），抑制它們的活性使細胞存活[12]。

進一步研究發現與VEGF共同凍存后的EOCs其p-Akt表達升高，Bad及Caspase 3活性片段表達均降低。通過wotmannin特異性抑制PI3K-Akt通路后，wortmannin干預組早期凋亡率較未干預組升高，與之對應的p-Akt表達降低，Bad及Caspase 3活性片段表達升高，由此我們推斷VEGF降低低溫凍存EOCs的凋亡率與PI3K-Akt-Bad通路有關[13]。本研究還發現，同時接受wortmannin干預的2組中，p-Akt及Bad表達差異無統計學意義，Caspase 3表達在W組中高于W+V組，提示VEGF對經wortmannin干預后凍存的EOCs仍具有一定的保護作用，其結果暗示除PI3KPKB/Akt-Bad信號通路外，VEGF也許還經其他信號通路起到抗凋亡的作用，如參與調控多種細胞凋亡的p38MAPK通路、鈣調神經磷酸酶通路等[14-15]。

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（本文編輯：吳彬）

Objective:To investigate the impact of vascular endothelial growth factor (VEGF) on the apoptosis rate in cryopreservation endothelial outgrowth cells (EOCs), as well as the relationship between VEGF and the PI3K-Akt-Bad signaling pathway, to research the mechanism of VEGF reducing the apoptosis rate in cryopreservation EOCs.Methods:The mononuclear cells were harvested from umbilical cord blood, induced into EOCs and expanded in vitro. The endothelial characteristics of the EOCs were identifed by immunocytochemical staining and fuorescence staining. The second generation of EOCs were devided into group W (cryoperserved after wortmannin intervention for 24 hours), group W+V (cryopreserved with 50 μg/L VEGF after wortmannin intervention for 24 hours), group BC (control group), and group V (cryopreserved with 50 μg/L VEGF). All these groups were resuscitated after being cryopreservated at -80 ℃ for 24 hours. Subsequently, apoptosis rates were detected by fow cytometry, and the expressions of p-Akt, Bad, and Caspase 3 were measured using Western-blot test.Results:The cells cultured by adherent method showed multiple endothelial characteristics. Although cryopreservation increased the apoptosis rate of EOC (5.36%±0.27%), VEGF protected cells from deep hypothermia and thus reduced the apoptosis rate of recovery cells (3.36%±0.27%, P＜0.05). Inhibition of PI3K by wortmannin decreased the protection of VEGF on the EOCs and increased the cellular apoptosis rate (8.34%±0.57%, P＜0.05). Western-blot test showed elevation of p-Akt expressions and decline of Bad and Caspase 3 expressions in EOCs cryopreserved with VEGF (P＜0.05). Under the PI3K inhibition by wortmannin, the expression of p-Akt was down-regulated while expressions of Bad and Caspase 3 were up-regulated (P＜0.05). Conclusion: VEGF decreases the apoptosis rate of cryopreserved EOCs partly via PI3K-Akt-Bad signal pathway.

vascular endothelium growth factor; endothelial outgrowth cells; cryopreservation; apoptosis; signaling pathway

R329.2

A

1000-2138（2014）12-0882-05

2014-07-10

溫州市科技局科研基金資助項目（Y20110032）。

酈錚錚（1982-），女，浙江臺州人，住院醫師，醫學碩士。

VEGF decreases the apoptosis rate of cryopreserved EOCs via PI3K-Akt-Bad signaling pathway

LI Zhengzheng1, LIN Yinuo2, GUO Yanhui2. 1.Department of Neurology, the First Affliated Hospital of Wenzhou Medical University Wenzhou, 325015; 2.Department of Cardiology, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015