甘藍型油菜GPAT6基因啟動子的克隆與表達載體構建

胡學芳，劉 聰，肖旦望，熊興華，2*

（1湖南農業大學／作物基因工程湖南省重點實驗室，長沙410128；2湖南農業大學油料作物所，長沙410128）

甘藍型油菜GPAT6基因啟動子的克隆與表達載體構建

胡學芳1，劉 聰1，肖旦望1，熊興華1，2*

（1湖南農業大學／作物基因工程湖南省重點實驗室，長沙410128；2湖南農業大學油料作物所，長沙410128）

通過同源PCR克隆的方法，首次從甘藍型油菜中克隆了甘油-3-磷酸?；D移酶6（sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase6，GPAT6）基因長1 110 bp的啟動子，并將其成功構建到植物表達載體pBI121上。重組載體可用于轉化擬南芥，探究甘藍型油菜GPAT6基因的組織表達特征。

甘藍型油菜；GPAT6基因；啟動子；基因克??；表達載體構建

甘油-3-磷酸?；D移酶是三酰甘油（Triacylglycerol，TAG）生物合成的關鍵酶之一［1］，催化TAG生物合成的起始步驟。在擬南芥中已發現10個GPAT基因家族成員［2］，分別命名為ATS1、AtGPAT1、AtGPAT2、AtGPAT3、AtGPAT4、AtGPAT5、AtGPAT6、AtGPAT7、AtGPAT8和AtGPAT9。各成員的定位不同，分別定位于質體GPAT（ATS1）［3］、線粒體GPAT（AtGPAT1／2／3）［4］和內質網GPAT（AtGPAT4／5／6／7／8／9）［2，5］。ATS1主要將?；鶑腶cyl-ACP轉移到G-3-P的sn-1位置上形成溶血磷脂酸（Lysophosphatidic acid，LPA）［6～8］，而家族中其他成員則以acyl-CoA為?；w［6］。陸生植物特異性GPAT（EC2.3.1.198）能將?；D移到甘油-3-磷酸的sn-2位上，形成sn-2單酰甘油（sn-2-Monoacylglycerol，sn-2 MAG）［4，9］。溶血磷脂酸在溶血磷脂酸?；D移酶的作用下得到第二個?；?，形成磷脂酸（Phosphatidic acid，PA）［10］。PA在磷脂酸磷酸酶的作用下，脫去磷酸基團形成二酰甘油（Diacylglycerol，DAG），經二酰甘油酰基轉移酶（Diacylglycerol acyltransferase，DGAT）的催化作用產生TAG［11］。

TAG是植物種子儲存脂的主要成分。Jain等［12］將紅花質體GPAT基因（CtpGPAT）轉入擬南芥中超表達，使其種子含油量提高了15%。Gidda等［5］對擬南芥AtGPAT9編碼的氨基酸序列進行生物信息學分析，推測其與擬南芥種子含油量有關。此外，GPAT基因家族的功能已在多種植物中展開。有研究證明，擬南芥［3］、菠菜（Spinacia oleracea）［13，14］、豌豆（Pisum sativum）［13，15］等質體GPAT酶對順9-十八碳烯酸（油酸）的親和力比較強［16］?？沟蜏啬芰θ醯闹参锶缒瞎希–ucurbita moschata）質體GPAT酶偏好于飽和脂肪酸［14］。Yan等［17］將甜椒的GPAT基因轉入煙草中超表達，提高了煙草耐高溫能力。Li等［18］發現，擬南芥gpat5突變體的幼根和種皮中軟木脂的含量下降，種子萌發和幼苗成活率顯著降低。擬南芥atgpat4／8雙突變體的莖和葉中表現出明顯的幾丁質缺陷［18］，atgpat6突變體的花瓣表現出幾丁質缺陷［19］。甘藍型油菜BnGPAT4干擾系葉片角質層有明顯幾丁質缺陷，氣孔不能正常關閉，使植株長期處于高蒸騰作用狀態，容易失水［20］。

油菜是重要的油料作物，在我國具有悠久的栽培歷史。目前我國面臨對食用油需求的日益增加和全球氣候變化帶來的干旱、鹽堿地面積擴大等問題，如何提高油菜的抗逆性對提高我國油菜單產具有重要意義。研究表明，甘油-3-磷酸?；D移酶家族與作物的育性［21，22］、種子含油量［12］和抗逆性［17，18，20，23，24］相關。其中擬南芥AtGPAT6與結實率有關。在花藥發育階段，擬南芥AtGPAT6在絨氈層和小孢子中大量表達。在本試驗之前筆者已經克隆了甘藍型油菜GPAT6基因的CDS序列。組織特異性表達及逆境脅迫表明，BnGPAT6基因表達豐度在油菜花中最高，受干旱、高鹽以及植物激素的影響。本研究通過同源克隆的方法獲得其啟動子，并構建植物表達載體，以為揭示GPAT6基因在油菜中的表達特征奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甘藍型油菜湘油15號；TransGen生物技術有限公司DNA提取試劑盒、TransTaq DNA Polymerase High Fidelity DNA聚合酶套裝、10 mmol／L dNTPs、質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、Hin dIII和Bam HI核酸內切酶以及T4DNA連接酶；TaKaRa生物有限公司的pMD18-T載體；植物表達載體pBI121。其他試劑均為分析純，購于上海國藥。

1.2 試驗方法

1.2.1 油菜DNA提取

用TransGen生物技術有限公司DNA提取試劑盒提取湘油15號幼葉DNA，試驗步驟參照試劑盒說明書。

1.2.2 引物設計

用油菜BnGPAT6（KC106728）基因的序列在白菜基因組序列中查找同源基因，根據BnGPAT6基因設計基因特異性引物BnGPAT6RS：CGTGGACTAGCTGTTACTATAT，根據白菜GPAT6基因的上游序列設計PCR上游引物Bra017137F： CCCAAGCTTTAACACTTGTGCTGCTATGTCC（下劃線處為Hin d III酶切位點）和Bra005137F： CCCAAGCTTTAACACTTGTGCTGCTATGTCC（下劃線處為Hin d III酶切位點）。BnGPAT6RS分別與Bra017137F和Bra005137配對進行PCR擴增。

1.2.3 啟動子克隆

以油菜基因組DNA為模板，用BnGPAT6RS分別與Bra017137F和Bra005137配對進行PCR擴增。PCR體系20μL：5 U／μL DNA聚合酶0.4μL，10 mmol／L dNTPs 0.4μL，10×PCR緩沖液2μL，50 ng／μL模板2μL，2μmol／L正反引物各2μL，ddH2O 11.2μL。PCR程序：95℃預變性5 min，94℃變性30 s，56℃復性30 s，共35個循環；72℃延伸90 s，72℃保溫8 min，16℃恒溫。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統（Bio-Rad）檢測和記錄結果。將PCR產物回收后與pMD18-T載體連接，轉化大腸桿菌感受態細胞，篩選陽性克隆送往華大基因測序，并提取測序成功菌落的質粒。質粒提取方法參照質粒提取試劑盒。

1.2.4 表達載體構建

用MEGA5.0將啟動子序列與白菜GPAT6基因的上游序列及甘藍型油菜GPAT6基因序列進行比對，確定目的序列為BnGPAT6基因啟動子序列后，根據其設計下游-引物BnGPAT6RB：CGCGGATCCACAAGAAGAGAAGAGAGAGAGC（下劃線處為BamH I酶切位點），以含有目的序列的質粒為模板，用引物Bra017137F與BnGPAT6RB進行PCR擴增。PCR產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳純化后，切膠回收。用Hin d III和Bam HI核酸內切酶對目的片段和pBI121質粒進行雙酶切。酶切體系為：DNA 10μL、10×K buffer 2μL、Hin d III和Bam HI核酸內切酶各1μL、ddH2O 6μL。將反應體系置于PCR儀中37℃反應4 h。酶切結束后用2%的瓊脂糖凝膠電泳純化反應產物，并回收。用T4連接酶將目的片段連接到切好的pBI載體上。連接體系20μL：載體DNA1μL、目的片段3μL、T4 DNA連接酶1 μL、5×連接緩沖液4μL、ddH2O 11μL。16℃反應12 h。將連接產物轉入大腸桿菌DH5α感受態細胞中，挑取抗性菌落進行菌落PCR檢測。提取菌落PCR檢測陽性菌落的質粒，進行雙酶切檢測。

2 結果與分析

2.1 啟動子的克隆

用BnGPAT6RS分別與Bra017137F和Bra005137配對進行PCR擴增，電泳檢測結果（圖1）表明，BnGPAT6RS與Bra017137擴增出1 500 bp左右的條帶，與預期目的片段大小相符。

圖1 PCR產物

將PCR產物回收后與T-vector連接，轉化大腸桿菌感受態細胞，篩選陽性克隆進行測序。序列比對結果（圖2）顯示，目的片段3′-端411個堿基（基因起始密碼子及其下游序列）與BnGPAT6基因序列完全一致，5′-端1 110個堿基與白菜Bra017137基因上游序列相似度很高，表明克隆了長度為1 110 bp的BnGPAT6基因啟動子。

圖2 BnGPAT6基因啟動子序列

2.2 表達載體的構建

以含有目的片段的T載體為模板，用引物Bra017137F與BnGPAT6RB進行PCR擴增，純化回收后進行雙酶切，然后用T4連接酶將目的片段連接到植物表達載體pBI121上（圖3），轉入大腸桿菌DH5α感受態細胞中。挑取抗性菌落進行PCR檢測（圖4），提取PCR檢測陽性菌落的質粒進行雙酶切檢測（圖5）。檢測結果表明，BnGPAT6基因啟動子成功替換pBI121上的CaMV 35S啟動子（圖3）。

圖3 表達載體結構

圖4 菌落PCR檢測

圖5 雙酶切檢測

3 結論與討論

本試驗通過同源PCR克隆的方法，克隆了油菜GPAT6基因的啟動子，并成功構建到pBI121載體上。

同源克隆是一種比較簡單可行的基因克隆方法。本試驗通過已經公布的甘藍型油菜BnGPAT6基因序列和白菜基因組序列設計引物，通過PCR成功克隆BnGPAT6基因的啟動子，并將其構建到植物表達載體pBI121上。目前外源基因導入植物的方法多采用農桿菌介導法，這就需要將外源目的基因整合在植物表達載體中。目前使用較多的植物表達載體是雙元表達載體，如pBI121、pCAMBIA系列。由于酶切位點的選取限制，本研究選取了pBI121作為表達載體。此外，pBI121載體具有GUS基因，其表達產物既不會影響植物生長，也不會轉移。因此，用油菜BnGPAT6基因啟動子替換pBI121載體上的CaMV 35S啟動子，通過農桿菌介導轉入植物中表達，經染色后，能直觀地看到BnGPAT6基因啟動子的活性及BnGPAT6基因的表達特征。

然而，油菜是異源四倍體植物，在油菜體細胞中，每個基因可能存在多個拷貝。目前已經公布了油菜BnGPAT6基因的兩個（KC106728、KJ000117）拷貝，因此，本試驗中克隆得到的啟動子只是多個拷貝中的1個，其表達活性只能體現KC106728的表達特征。因此，要了解BnGPAT6基因的表達特征，還需弄清油菜中GPAT6基因的拷貝數并獲得其啟動子，或借助其他的方法做進一步的研究。

［1］ Gupta SM，Pandey P，Grover A，et al.Cloning and characterization of GPAT gene from Lepidium latifolium L.：a step towards translational research in agri-genomics for food and fuel［J］.Mol Biol Rep，2013，40（7）：4235-4240.

［2］ Chen X，Snyder CL，Truksa M，et al.sn-Glycerol-3-phosphate acyltransferases in plants［J］.Plant Signal Behav，2011，6（11）：1695-1699.

［3］ Nishida I，Tasaka Y，Shiraishi H，et al.The gene and the RNA for the precursor to the plastid-located glycerol-3 -phosphate acyltransferase of Arabidopsis thaliana［J］. PlantMol Biol，1993，21（2）：267-277.

［4］ Yang W，Simpson JP，Li-Beisson Y，et al.A land-plant -specific glycerol-3-phosphate acyltransferase family in Arabidopsis：substrate specificity，sn-2 preference，and evolution［J］.Plant Physiol，2012，160（2）：638-652.

［5］ Gidda SK，Shockey JM，Rothstein SJ，et al.Arabidopsis thaliana GPAT8 and GPAT9 are localized to the ER and possess distinct ER retrieval signals：functional divergence of the dilysine ER retrievalmotif in plant cells［J］.Plant Physiol Biochem，2009，47（10）：867-879.

［6］ Chen X，Snyder CL，Truksa M，et al.sn-Glycerol-3-phosphate acyltransferases in plants［J］.Plant Signal Behav，2011，6（11）：1695-1699.

［7］ Wendel AA，Lewin TM，Coleman RA.Glycerol-3-phosphate acyltransferases：rate limiting enzymes of triacylglyc-erol biosynthesis［J］.Biochim Biophys Acta，2009，1791（6）：501-506.

［8］ Zhang YM，Rock CO.Thematic review series：Glycerolipids.Acyltransferases in bacterial glycerophospholipid synthesis［J］.JLipid Res，2008，49（9）：1867-1874.

［9］ YangW，Pollard M，Li-Beisson Y，et al.A distinct type of glycerol-3-phosphate acyltransferase with sn-2 preference and phosphatase activity producing 2-monoacylglycerol［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2010，107（26）：12040 -12045.

［10］Bourgis F，Kader JC，Barret P，et al.A plastidial lysophosphatidic acid acyltransferase from oilseed rape［J］.Plant Physiol，1999，120（3）：913-922.

［11］Lung SC，Weselake RJ.Diacylglycerol acyltransferase：a keymediator of plant triacylglycerol synthesis［J］.Lipids，2006，41（12）：1073-1088.

［12］Jain RK，Coffey M，Lai K，et al.Enhancement of seed oil content by expression of glycerol-3-phosphate acyltransferasegenes［J］.Biochem Soc Trans，2000，28（6）：958-961.

［13］Bertrams M，Heinz E.Positional specificity and fatty acid selectivity of purified sn-glycerol3-phosphate acyltransferases from chloroplasts［J］.Plant Physiol，1981，68（3）：653-657.

［14］Tamada T，Feese MD，Ferri SR，et al.Substrate recognition and selectivity of plant glycerol-3-phosphate acyltransferases（GPATs）from Cucurbitamoscata and Spinacea oleracea［J］.Acta Crystallogr D Biol Crystallogr，2004，60（Pt1）：13-21.

［15］Weber S，Wolter FP，Buck F，et al.Purification and cDNA sequencing of an oleate-selective acyl-ACP：sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase from pea chloroplasts［J］.Plant Mol Biol，1991，17（5）：1067-1076.

［16］Cronan JE，Roughan PG.Fatty acid specificity and selectivity of the chloroplast sn-glycerol 3-phosphate acyltransferase of the chilling sensitive plant，Amaranthus lividus［J］.Plant Physiol，1987，83（3）：676-680.

［17］Yan K，Chen N，Qu YY，etal.Overexpression of sweet pepper glycerol-3-phosphate acyltransferase gene enhanced thermotolerance of photosynthetic apparatus in transgenic tobacco［J］.J Integr Plant Biol，2008，50（5）：613-621.

［18］Li Y，Beisson F，Koo AJ，et al.Identification of acyltransferases required for cutin biosynthesis and production of cutin with suberin-like monomers［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（46）：18339-18344.

［19］Li-Beisson Y，Pollard M，Sauveplane V，et al.Nanoridges that characterize the surface morphology of flowers require the synthesis of cutin polyester［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2009，106（51）：22008-22013.

［20］Chen X，Truksa M，Snyder CL，et al.Three homologous genes encoding sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase 4 exhibit differentexpression patterns and functional divergence in Brassica napus［J］.Plant Physiol，2011，155（2）：851-865.

［21］Li X C，Zhu J，Yang J，et al.Glycerol-3-phosphate acyltransferase 6（GPAT6）is important for tapetum development in Arabidopsis and playsmultip le roles in plant fertility［J］.Mol Plant，2012，5（1）：131-142.

［22］Zheng Z，Xia Q，Dauk M，et al.Arabidopsis AtGPAT1，a member of themembrane-bound glycerol-3-phosphate acyltransferase gene family，is essential for tapetum differentiation and male fertility［J］.Plant Cell，2003，15（8）：1872-1887.

［23］Sui N，Li M，Zhao SJ，et al.Overexpression of glycerol-3 -phosphate acyltransferase gene improves chilling tolerance in tomato［J］.Planta，2007，226（5）：1097-1108.

［24］Szalontai B，Kota Z，Nonaka H，et al.Structural consequences of genetically engineered saturation of the fatty acids of phosphatidylglycerol in tobacco thylakoid membranes.An FTIR study［J］.Biochemistry，2003，42（14）：4292-4299.

Cloning and Expression Vector Construction of GPAT6 Gene Promoter in Brassica napus

HU Xue-fang1，LIU Cong1，XIAO Dan-wang1，XIONG Xing-hua1，2*
（1 Hunan Agricultural University／Crop Gene Engineering Key Laboratory of Hunan Province，Changsha，Hunan 410128，China；2 Oilseed Crops Institute，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China）

In this study，the promoter，1 110 bp in length，of GPAT6 gene was cloned from B.napus at the first time by homology-based PCR cloning，and then itwas constructed to plant expression vector pBI121.The recombinant vector could be transformed into Arabidopsis thaliana to study the tissue expression pattern of GPAT6 gene in B.napus.

Brassica napus；GPAT6 gene；Promoter；Gene cloning；Expression vector construction

Q78；S565.401

A

1001-5280（2014）05-0467-05 DOI：10.3969／j.issn.1001-5280.2014.05.04

2014 04 16

胡學芳（1989-），女，湖南婁底人，碩士研究生，Email：472209985＠qq.com。*通信作者：熊興華，博士，副教授，Email：xionggene＠yahoo.com。

國家高技術研究發展計劃（“863”計劃）項目（2012AA101107-3）；湖南省科技廳項目（06FJ4264，07RS4014）。