延安地區馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的RT－PCR檢測與序列分析

馮光惠，杜虎平，李夏隆，亢福仁

(榆林學院生命科學學院，陜西榆林 719000)

馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(Potato spindle tuber viroid，PSTVd)是由類病毒(viroid)引起的危害馬鈴薯產量和品質的主要病害，PSTVd通常減產20% ～60%，嚴重可導致馬鈴薯種質退化，與馬鈴薯X病毒、Y病毒等病毒復合侵染時減產更嚴重，給農民造成巨大的經濟損失。PSTVd極易通過種薯(苗)、花粉、種子、機械或昆蟲等多種途徑傳播，侵染后潛伏期長并持續感染，不能經過莖尖脫毒除去，因而篩選無毒馬鈴薯種苗是減輕病害、保持優良種質、提高馬鈴薯產量和品質的有效措施。建立快速、靈敏、準確的類病毒檢測技術是保證無毒種苗(薯)生產的關鍵［1］。

PSTVd是一種無蛋白質外殼的侵染性單鏈環狀RNA分子。由于沒有蛋白質外殼，不具有抗原性，不能采用血清學方法檢測。近年來，RT－PCR檢測技術廣泛應用于馬鈴薯各種病毒和紡錘塊莖類病毒的檢測，在病毒或類病毒含量極低時也可以快速檢測，該方法具有靈敏、快速、準確度高、特異性強等優點，適用于馬鈴薯及其他植物病毒或類病毒的檢測。國內研究者采用RT－PCR方法檢測了不同地區的馬鈴薯紡錘塊莖類病毒。董代幸等［2］檢測了烏魯木齊地區的馬鈴薯紡錘塊莖類病毒，并擴增出251 bp的目的片段，與國內外已報道的核酸序列同源性達93.6% ～99.2%;吳志明等［3］檢測了河北地區的馬鈴薯紡錘塊莖類病毒，并擴增出360 bp的目的片段，與國內外已報道的核酸序列同源性達98%以上;呂典秋等［4］檢測了東北地區的馬鈴薯紡錘塊莖類病毒，擴增出359 bp的目的片段，在與國外序列比較中發現了互換和突變現象。在RT－PCR檢測技術基礎上，王中康等［5］和 Nie等［6］應用多重 RT －PCR技術分別檢測了馬鈴薯PVX、PVY、PVA、PVS、PLRV 5種病毒和1種紡錘類病毒(PSTVd)，極大地提高了馬鈴薯病毒和類病毒的檢測效率。

延安地區的馬鈴薯種植面積約占陜西省馬鈴薯種植總面積的20%，馬鈴薯是帶動地方農業經濟發展的重要農作物，每年不斷增加脫毒種薯種植面積和引進新品種，隨著種植年代的增加，病毒在馬鈴薯體內不斷積累，嚴重影響馬鈴薯的產量和品質。目前尚未見用RT－PCR法檢測和分析延安地區馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的報道。本試驗以延安地區不同鄉鎮種植2～3代的疑似帶病毒馬鈴薯為研究對象，采用RT－PCR方法檢測該地區的馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(PSTVd)，并對PSTVd基因序列進行分析，了解PSTVd的變異程度，以期為脫毒馬鈴薯的種苗(薯)繁育和推廣種植提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

(1)樣品的采集。在馬鈴薯生長盛期至成熟期，采集馬鈴薯疑似帶病毒植株葉片，于常溫下保存于保濕組織培養瓶中，運回實驗室后于4℃冰箱保存。馬鈴薯樣品信息見表1。

表1 本研究中所用馬鈴薯樣品信息

(2)儀器與試劑。主要儀器有PCR儀、高速冷凍離心機、電泳系統、凝膠成像系統。Trizol試劑及cDNA合成試劑盒、DNA膠回收試劑盒、pGEMTeasy載體、Taq DNA 聚合酶、dNTP、10×buffer均購自北京全式金生物科技有限公司。

(3)引物設計。根據GenBank數據庫中登錄的馬鈴薯紡錘塊莖類病毒基因組序列，利用引物設計軟件Primer 5設計1對特異引物，上游引物為5'－GAAACCTGGAGCGAACTG－3'，下游引物為5'－CG GTTCCAAGGGCTAAAC－3'。預期擴增片段長度為251 bp，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，將其用滅菌TE(pH 8.0)稀釋至濃度為10 μmol/L。

1.2 方法

(1)馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的RT－PCR檢測。

馬鈴薯總RNA的提取。采用Trizol法，參照文獻［7］方法進行，略做改動。具體步驟是:稱取0.1 g馬鈴薯葉片在研缽中用液氮研磨，取1.5 mL離心管加入1 mL Trizol液，將研磨液與Trizol液混合均勻;4℃、12 000 r/min離心15 min;轉移上清液至另一離心管中，加入0.2 mL氯仿，渦旋混勻，室溫放置5 min，4℃、12 000 r/min 離心 15 min;取上清液(水相)于另一離心管中，按上清液體積分別加入1/2體積的異戊醇、0.8 mol/L檸檬酸鈉和1.2 mol/L氯化鈉，混合均勻，室溫放置5～10 min，4℃、12 000 r/min離心8 min，棄上清液，用1 mL 75%的乙醇洗滌沉淀2次，4℃、12 000 r/min離心15 min，小心倒掉乙醇，室溫自然干燥后溶于用 DEPC處理過的ddH2O，于－80℃條件下保存。

cDNA的合成。按照cDNA合成試劑盒說明書操作，對提取的馬鈴薯葉片總RNA進行反轉錄。具體反應體系如下:馬鈴薯總RNA 5 μL，Anchored Oligo(dT)18(0.5 μg/μL)1 μL，2 × ES Reaction Mix 10 μL，EasyScript RT Enzyme Mix 1 μL，加 RNase －free Water至20 μL。混勻后，水浴鍋中42℃孵育30 min，PCR儀中于85℃條件下加熱失活5 min。

PCR反應及產物檢測。PCR反應體系:cDNA 3 μL，上游引物 1 μL，下游引物 1 μL，10 × buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，Taq DNA 聚合酶1 μL，加ddH2O至 50 μL。PCR反應程序:94℃ 5min;94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35 個循環;72℃10 min。取 6 μL PCR 擴增產物與 1 μL Loading Buffer混勻，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，于凝膠成像系統中照相。

(2)克隆及序列分析。用DNA膠回收試劑盒回收純化PCR產物，將其與pGEM－Teasy載體連接過夜，轉化大腸桿菌Trans1－T1感受態細胞，在加有IPTG和X－gal的LB平板上篩選白色菌落，于LB液體培養基中培養，采用堿裂解法提取質粒，采用EcoRⅠ和HindⅢ限制性內切酶對重組質粒進行鑒定。將含目的條帶的陽性重組質粒送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。用DNAstar軟件分析類病毒基因序列相似性，并與GenBank中搜索國內外14個不同地區(表2)的馬鈴薯紡錘塊莖類病毒基因進行序列相似性分析。

表2 國內外14個不同地區馬鈴薯紡錘塊莖類病毒序列的信息

2 結果與分析

2.1 馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的RT－PCR檢測

對采自延安地區8個縣(區)不同鄉鎮馬鈴薯葉片所含紡錘塊莖類病毒的 RT－PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結果發現均能擴增出預期長度的目的條帶(圖1)，表明這些馬鈴薯植株均感染了PSTVd。

圖1 馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的RT－PCR檢測結果

2.2 馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的序列一致性分析

用DNAstar軟件對馬鈴薯紡錘塊莖類病毒序列進行分析，結果表明，延安地區8個縣(區)各鄉鎮PSTVd序列大小為247～251 bp，出現少量堿基突變或缺失，并對編碼的氨基酸產生影響，該地區8個采樣點之間的序列一致性也有所差異，處在98.2% ～99.7%之間，表明該地區部分鄉鎮的PSTVd基因序列發生了一定程度的變異。其中，志丹縣順寧鎮、安塞縣化子坪鎮和寶塔區萬花鄉之間的序列一致性為99.7%;子長縣欒家坪鄉和延川縣馬家河鄉之間的序列一致性為99.5%;宜川縣丹川鎮、富縣直羅鎮、吳起縣鐵邊城鎮和其它鄉鎮之間的序列一致性相對較低。就地理位置而言，延安地區中南部的宜川縣丹川鎮、富縣直羅鎮的PSTVd變異程度較高，北部縣區各鄉鎮的PSTVd變異較輕。以志丹縣順寧鎮、延川縣馬家河鄉、宜川縣丹川鎮、富縣直羅鎮的馬鈴薯紡錘塊莖類病毒基因序列為對照，與國內外其他地區14個樣品的PSTVd基因進行比較，序列一致性在80.4% ～99.2%(表3)。

表3 馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的序列一致性分析

3 討論

本研究調查發現，延安地區8個縣(區)不同鄉鎮最近幾年都在推廣種植脫毒馬鈴薯，但一級脫毒種薯種植2～3年后，馬鈴薯植株出現不同癥狀，產量也呈逐年下降趨勢，說明馬鈴薯單一病毒(類病毒)或各種復合病毒在馬鈴薯體內存在。原因之一是地方檢疫部門對馬鈴薯脫毒苗及各級種薯的檢驗檢疫監督不嚴，造成將帶毒種薯發放給農民種植;二是脫毒馬鈴薯都是通過莖尖剝離組織培養脫毒的，而馬鈴薯紡錘塊莖類病毒很難通過莖尖剝離脫毒，造成多數脫毒種苗(薯)脫除了病毒，實際還攜帶類病毒，只是單獨類病毒對產量和品質的影響不夠明顯，在田間種植2～3代后，與其他病毒復合感染，從而造成產量和品質明顯下降。

RT－PCR分子檢測技術可快速、準確地檢測馬鈴薯的帶毒情況，是近年來國內外應用較為普遍的病毒檢測技術，該技術的應用對脫毒馬鈴薯種薯的推廣及馬鈴薯產業的發展具有重要意義。筆者認為，在普通RT－PCR體系中，只要提取的馬鈴薯總RNA品質高，在檢測不同種類的病毒和類病毒時，設計不同的特異引物，就能擴增出預期的目的條帶，而且不會發生假陰性現象，檢測效果好。另外，在用RT－PCR檢測類病毒PSTVd以及常見的6種病毒PVX、PVY、PVS、PVA、PVM 和 PLRV 時，可通過改變PCR反應體系中的溫度，從而在PCR儀中實現多種病毒的同步檢測。

通過克隆測序，可了解馬鈴薯病毒或類病毒的變異程度。馬鈴薯不同病毒或類病毒的變異也有差異，本試驗研究延安地區8縣(區)不同鄉鎮馬鈴薯紡錘類病毒基因的序列一致性在98.2%～99.7%，而同為陜北地區的榆林10縣區不同鄉鎮的PSTVd的序列一致性均在99.7%以上，病毒變異率高低以及不同地區病毒變異率差異大小是否會對馬鈴薯的產量和品質產生影響，單一病毒或類病毒及復合病毒感染對產量和品質的影響關系都有待進一步研究。

［1］Navarro B，Silletti MR，Serio FD.Identification and characterization of potato spindle tuber viroid infecting tomato in Italy［J］.Journal of Plant Pathology，2009，91(3):723－726.

［2］董代幸，羅 明，王麗麗，等.烏魯木齊地區馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的檢測與序列分析［J］.西北農業學報，2010，19(9):38 －42.

［3］吳志明，賈曉梅，謝曉亮，等.馬鈴薯紡錘塊莖類病毒RT－PCR檢測及全序列分析［J］.華北農學報，2003，18(S1):63－65.

［4］呂典秋，李學湛，楊希才，等.馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(PSTVd)東北分離物的核苷酸序列分析［J］.農業生物技術學報，2005，13(1):131 －132.

［5］王中康，夏玉先，袁 青，等.馬鈴薯種苗復合感染病毒多重RT－PCR同步快速檢測［J］.植物病理學報，2005，35(2):109 －115.

［6］Nie X，Singh RP.A novel usage of random primers for multiplex RT－PCR detection of virus and viroid in aphids，leaves，and tubers［J］.Journal of Virological Methods，2001，91(1):37 －49.

［7］Courtney EJ，Amy OC，David KW.Evaluation of isolation methods and RNA integrity for bacterial RNA quantitation［J］.Journal of Microbiological Methods，2008，75(2):318－324.