重癥監護室耐碳青酶烯類鮑曼不動桿菌的基因分型

鄭培烝，鄒 紅，傅芬蕊，潘玉紅，黃心宏，曹穎平

重癥監護室耐碳青酶烯類鮑曼不動桿菌的基因分型

鄭培烝，鄒 紅，傅芬蕊，潘玉紅，黃心宏，曹穎平

目的了解筆者醫院重癥監護室（ICU）分離的耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌（CRAB）的分子流行病學特點。方法收集2010年9月－2012年3月ICU分離的CRAB共34株，其中綜合ICU 25株，燒傷ICU 9株，采用基于rep-PCR原理的DiversiLab系統進行基因分型分析。結果34株CRAB共分A、B、C和D 4型，燒傷ICU中存在A和D型，以A型為主且A型僅出現在燒傷ICU；綜合ICU中存在B，C和D型，以D型為主且B和C型僅出現在綜合ICU。結論燒傷ICU和綜合ICU中流行的CRAB基因型不同。D型CRAB同時存在兩個ICU中提示ICU間可能存在交叉感染。

鮑氏不動桿菌；不動桿菌感染；抗菌藥；青霉屬；碳；聚合酶鏈反應；基因；序列分析，DNA

鮑曼不動桿菌是一群不發酵糖類和氧化酶陰性的革蘭陰性球桿菌。隨著抗生素廣泛應用所產生的選擇性壓力，目前鮑曼不動桿菌對現有幾乎所有種類的抗生素的敏感性逐年下降，特別是對碳青霉烯類抗生素的耐藥率逐年上升越來越受到關注。耐碳青酶烯類鮑曼不動桿菌（carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii，CRAB）是引起醫院感染的常見病原菌之一［1］。對其進行分子流行病學監測對控制CRAB的傳播，及早和準確地發現耐藥菌株來源和確定傳播方式至關重要。

基于DNA重復序列PCR（repetitive element PCR，rep-PCR）技術的DiversiLab分型系統具有操作簡便、反應快速、重復性好等特點，其分型結果與脈沖場凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）有較好的一致性，已成為醫院感染分子流行病學研究的理想方法之一［2］。因此，本研究采用DiversiLab分型系統對CRAB菌株進行基因分型和同源性分析。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集筆者醫院2010年9月—2012年3月間燒傷ICU和綜合ICU分離到的CRAB，標本類型有痰、血液、尿液和胸腹水等。

1.2 儀器和試劑 全自動細菌鑒定儀（VITEKⅡCompact型，法國生物梅里埃公司）；生物分析儀（2100型，美國 Agilent公司）；藥敏卡（批號：106197910，法國生物梅里埃公司）；超純微生物DNA提取試劑盒（批號：BMX11A7，美國 MOBIO公司）；鮑曼不動桿菌rep-PCR分型試劑盒（批號：AC061201，法國生物梅里埃公司）；DiversiLab DNA芯片（批號：QC20RK01，法國生物梅里埃公司）。

1.3 菌種鑒定 所有CRAB菌株經全自動細菌鑒定儀鑒定，同時做42℃培養和氧化－發酵試驗驗證。使用藥敏卡進行藥敏試驗，亞胺培南和／或美羅培南耐藥的不動桿菌再通過K-B法驗證是否對亞胺培南和／或美羅培南耐藥。以上藥敏結果根據美國臨床實驗室標準化研究所（CLSI）2012年版的抗菌藥物敏感性試驗標準判斷［3］。鑒定為鮑曼不動桿菌且亞胺培南和／或美羅培南耐藥的菌株共34株。

1.4 基因分型

1.4.1 DNA提取 取MH平板上過夜培養的菌落用于DNA提取，按照超純微生物DNA提取試劑盒操作說明書提取細菌基因組DNA，測定其OD260／280值，調整濃度在30～70mg／L之間。

1.4.2 rep-PCR 擴增 根據鮑曼不動桿菌rep－PCR分型試劑盒的要求，配制25μL PCR反應體系：重復序列PCR MMI 18μL，GeneAmp＠10×PCR緩沖液2.5μL，引物混合物2μL，AmpliTaq＠DNA聚合酶0.5μL，基因組DNA模板2μL。反應參數為預變性94℃2min→變性94℃30s→退火50℃30s→延伸70℃90s，共35個循環，70℃延伸3min。

1.4.3 PCR擴增產物檢測 將PCR產物用配套的DiversiLab DNA芯片和生物分析儀檢測。

1.4.4 結果分析 使用DiversiLab分型系統配套軟件分析，得到各菌株相應的電泳圖及進行同源性分析。

2 結 果

2.1 CRAB基因分型結果 共收集并確證CRAB標本34株，其中燒傷ICU 9株，綜合ICU 25株。34株菌株顯示A、B、C、D四個型別，其中A型7株，只出現在燒傷ICU；B型2株和C型1株，只出現在綜合ICU；D型24株，燒傷ICU 2株和綜合ICU 22株（圖1）。

2.2 34株CRAB間同源性分析 不同菌株間的同源性用不同顏色來表示，深紅色表示菌株間同源性為95%～100%，淺紅色為90%～95%，藍色為80%～90%，黃色為70%～80%，灰色則低于70%。從圖中可看出各型CRAB的不同菌株間都有很好的同源性。A型和B型CRAB間的同源性較好，但與D型CRAB間的同源性較差（圖2）。

3 討 論

圖2 34株ICU分離的CRAB同源性分析Fig 2 Homologous analysis of 34CRAB strains isolated from ICUs patients

鮑曼不動桿菌是引起醫院感染的常見病原菌之一，特別是在ICU和血液科等特殊科室，主要導致呼吸機相關肺炎、傷口感染和敗血癥等疾病。CRAB往往表現出多重耐藥的特性，它的出現和流行使得臨床治療變得十分困難，病死率較高［4］。為了控制CRAB傳播，及早和準確地發現耐藥菌株來源和型別鑒定十分重要。本研究通過基于rep-PCR的DiversiLab分型系統對34株臨床分離的CRAB進行基因分型，將其分為4種基因型，說明這些菌株來源不同。燒傷ICU存在A型和D型CRAB，其中A型比例達到77.8%，說明A型是燒傷ICU中的流行株，而且A型僅出現在燒傷ICU不存在于綜合ICU提示A型CRAB來源于燒傷ICU自身。在綜合ICU中存在B、C和D型，其中D型占88.0%，說明D型是綜合ICU的流行株。D型同時存在于燒傷ICU和綜合ICU提示兩個ICU間可能存在交叉感染。

引起ICU中CRAB流行的傳染源主要來源于感染或定植CRAB的患者和環境中的CRAB，這就要求醫務工作者增強醫院感染的防控意識，重視手衛生，切斷可能的傳播途徑，同時要注意環境的監測和消毒工作。發現CRAB感染的患者應及時采取隔離措施，防止感染的進一步爆發。

目前用于鮑曼不動桿菌的基因分型主要方法是PFGE。PFGE是公認的微生物分子分型方法的金標準［5］。但是PFGE操作復雜，所需時間長，不同實驗室之間的可重復性較差，不利于不同實驗室間的比較。DiversiLab分型系統是一款基于rep-PCR原理的微生物基因分型系統，可使樣本準備、rep－PCR、電泳及結果分析能在短時間內完成，操作簡單，重復性好。DiversiLab分型系統配套的分析軟件是一款基于網絡在線分析的軟件，這為不同實驗室間菌株的比對提供了便利，同時也為數據庫的建立提供條件。通過比較筆者實驗室和國內外其他實驗室利用DiversiLab分型系統對CRAB進行基因分型的圖譜［6－8］，發現筆者醫院ICU中CRAB流行株的基因型和別的實驗室不盡相同，提示不同地區流行的CRAB來源于不同的克隆株，同時也說明建立本地區CRAB監控平臺的重要性。目前Diversi－Lab分型系統已廣泛應用于鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、分枝桿菌屬、念珠菌屬和曲霉菌的基因分型，已被證明是微生物分子流行病學研究很好的平臺［9－11］。

下階段將在CRAB分子流行病學研究的基礎上對其耐藥分子機制和抗菌藥物敏感試驗進行系統研究，這將對指導臨床合理使用抗生素、延緩耐藥性的發生和發現新的耐藥類型等方面有重要意義。

［1］Abbott I，Cerqueira G M，Bhuiyan S，etal.Carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii：laboratory challenges，mechanistic insights and therapeutic strategies［J］.ExpertRevAnti InfectTher，2013，11（4）：395-409.

［2］Grisold A J，Zarfel G，Strenger V，etal.Use of automated repetitive-sequence-based PCR for rapid laboratory confirmation of nosocomial outbreaks［J］.JInfect，2010，60（1）：44-51.

［3］Clinical and Laboratory Standards Institute.Performancestandardsforantimicrobialsusceptibilitytesting；twenty-second informationalsupplement［S］.Wayne：Clinical and Laboratory Standards Institute，2012：64.

［4］Maragakis L L，Perl T M.Acinetobacter baumannii：epidemiology，antimicrobial resistance，and treatment options［J］.ClinInfectDis，2008，46（8）：1254-1263.

［5］MacCannell D.Bacterial strain typing［J］.ClinLabMed，2013，33（3）：629-650.

［6］Higgins P G，Dammhayn C，Hackel M，etal.Global spread of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii［J］.JAntimicrobChemother，2010，65（2）：233-238.

［7］Yan Z Q，Shen D X，Cao J R，etal.Susceptibility patterns and molecular epidemiology of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii strains from three military hospitals in China［J］.IntJAntimicrobAgents，2010，35（3）：269-273.

［8］謝紅梅，胡必杰，陶黎黎，等.重癥監護病房環境與臨床分離耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌的REP-PCR分型研究［J］.中華微生物與免疫學雜志，2011，31（10）：903-906.

［9］Habeeb MA，Haque A，Nematzadeh S，etal.High prevalence of 16SrRNA methylase RmtB among CTX-Mextended-spectrumβ-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae from Islamabad，Pakistan［J］.IntJAntimicrobAgents，2013，41（6）：524-526.

［10］Clarridge J E 3rd，Harrington A T，Roberts MC，etal.Impact of strain typing methods on assessment of relationship between paired nares and wound isolates of methicillin-resistant Staphylococcus aureus［J］.JClinMicrobiol，2013，51（1）：224-231.

［11］Al-Hajoj S A，Akkerman O，Parwati I，etal.Microevolution of Mycobacterium tuberculosis in a tuberculosis patient［J］.J ClinMicrobiol，2010，48（10）：3813-3816.

（編輯：張慧茹）

Genotyping of Carbapenem-resistant Acinetobacter Baumannii Strains Isolated from Intensive Care Units

ZHENG Peizheng，ZOU Hong，FU Fenrui，PAN Yuhong，HUANG Xinhong，CAO Yingping
Department of Clinical Laboratory，Fujian Medical University Union Hospital，Fuzhou 350001，China

ObjectiveTo investigate the molecular epidemiology of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii（CRAB）strains collected from intensive care units（ICUs）in our hospital.Methods34 CRAB strains were collected and isolated at ICUs of our hospital during the period of September 2010to April 2012，of which 25from general ICU，and 9from Burn ICU. Genotyping was performed by Diversilab repetitive element PCR system.. ResultsThere were 4types of CRAB strains，including type A，B，Cand D. Type A and D CRAB strains existed in Burn ICU Type A dominated. Type B，C and D CRAB strains were found in general ICU with Type D dominant.ConclusionThe epidemic strains of CRAB in Burn ICU was different from that in general ICU，and the type D CRAB strain appeared simultaneously in both the ICUs suggesting that a cross infection may prevail in the two ICUs.

Acinetobacter baumannii；Acinetobacter infections；anti-bacterial agents；penicillium；carbon；polymerase chain reaction；genes；sequence analysis，DNA

R378.7；R394.2；R978.1

A

1672-4194（2014）01-0057-03

2013-11-19

福建醫科大學 附屬協和醫院檢驗科，福州 350001

鄭培烝（1974－），男，主任技師，副教授，醫學博士.Email：zhengpeizheng＠aliyun.com