新生霉素衍生物FM-Nov17抑制慢粒白血病細胞增殖與其誘導DNA損傷的關系

吳麗賢， 黃立森， 陳顯凌， 柯 方， 鄭 鳴， 許建華

新生霉素(Nov)是香豆素類抗生素的代表藥物，對DNA拓撲異構酶Ⅱ有很好的抑制作用[1]，在體內外能夠抑制多種癌細胞的增殖，但由于其活性較低，一般用于抗癌藥聯合應用及逆轉抗癌藥的耐藥性[2]。前期對Nov的抗腫瘤機制的研究還表明，Nov是熱休克蛋白90(HSP90)的C端抑制劑，能夠抑制HSP90的分子伴侶功能，影響客戶蛋白的正確結構和功能，間接發揮抗腫瘤作用，但其抗癌活性很低，對白血病K562細胞的IC50高達500 μmol/L[3-4]。

損傷DNA是當前臨床治療腫瘤常用的放射治療及絕大多數細胞毒類抗癌藥物共同的分子機制。在DNA損傷中，雙鏈斷裂對腫瘤細胞是最致命的打擊，主要檢測性標志是γ-H2AX；它的修復主要通過兩種機制實現：一種是同源重組(HR)，另一種是非同源末端連接(NHEJ)，斷裂的DNA末端重新連接，可以在沒有模板的情況下進行DNA修復，但也更容易發生錯誤。DNA修復能力異常激活和增強是導致腫瘤對DNA損傷劑耐藥的重要分子基礎；相反，修復缺陷則使腫瘤對其高敏感。目前已有十余種靶向不同DNA修復分子的化合物正在進行不同階段的臨床試驗。

本課題組以Nov為母體化合物進行改造，獲得一系列衍生物，通過體外抗腫瘤活性的篩選，獲取了抗腫瘤活性較強的化合物FM-Nov17。本研究試圖探討FM-Nov17在體外抗K562及K562/G01細胞增殖的作用與其誘導DNA損傷的關系。

1 材料與方法

1.1材料 K562和K562/G01細胞(由福建醫科大學生物醫藥工程中心庫存保種)；化合物FM-Nov17由本課題組合成，純度96%以上；羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE)、RNA酶和碘化丙啶(PI)；四甲基偶氮唑鹽(MTT，美國Sigma公司)；二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma公司)；RPMI 1640培養基、胎牛血清(美國Hyclone公司)；γ-H2AX，p-ATM，p-Chk1，p-Chk2，Parp，p-P53，CDC25A，CDC25C，cleaved Caspase3單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；β-actin單克隆抗體和羊抗鼠、羊抗兔IgG-HRP二抗(南京凱基生物科技發展有限公司)；ECL超強發光底物(美國Signalway antibody公司)；BCA蛋白定量試劑盒與流式凋亡檢測試劑盒(瑞士Roch公司)；JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒(南京凱基公司)；成像系統(Image station 4000MM，日本柯達公司)；流式細胞儀(FACSCanto Ⅱ，美國BD公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養 K562細胞采用含10%胎牛血清的RPMI 1640、青霉素(100 IU/mL)和鏈霉素(50 μg/mL)，于37 ℃、體積分數為0.05的CO2孵育箱中培養；K562/G01細胞采用含10%胎牛血清的RPMI 1640、青霉素(100 IU/mL)和鏈霉素(50 μg/mL)，于4 μmol/L IM維持培養，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2MTT試驗 96孔培養板上每孔種植10 000個細胞，體積為200 μL，實驗組分別加入不同濃度的FM-Nov17和Nov，對照組不加藥。另設空白組(只加培養基，無細胞)，每組設3個副孔，37 ℃培養48 h，每孔加入5 μg/mL的MTT溶液20 μL[4]，繼續培養4 h，1 000 r/min離心5 min棄上清，加入150 μL DMSO，振蕩10 min，用全自動酶標儀檢測570 nm處的吸光度(OD)值，結果采用GraphPad Prism 5 軟件分析，并繪制相應的存活率-對數濃度曲線，計算藥物的半數抑制率(IC50)。

1.2.3細胞增殖代數檢測 取對數生長期的K562及K562/G01細胞，用5 μmol/L CFSE 37 ℃預先處理10 min[5]，用4 ℃的含有10% FBS的RPMI 1640培養液終止反應并洗滌細胞2次，按實驗設計分組并加入不同濃度的FM-Nov17處理72 h。收集細胞，PBS洗滌2次，流式細胞儀檢測，結果采用Modfit軟件分析。

1.2.4DNA損傷檢測 取對數生長期K562及K562/G01細胞，10 μmol/L的Brdu預處理30 min，不同濃度的FM-Nov17處理細胞24 h，收集細胞，以800 r/min離心5 min，棄上清，破膜，DNase處理1 h，anti-BrdU，anti-γ-H2AX，anti-cleaved Parp熒光探針室溫孵育20 min，按試劑盒說明操作，流式細胞儀檢測。

1.2.5細胞線粒體膜電位檢測 取對數生長期的K562和K562/G01細胞，分組并加入不同濃度的FM-Nov17處理4 h；收集細胞，1 000 r/min離心5 min；用冷PBS重懸洗滌細胞2次；按JC-1試劑盒的說明配置JC-1染料，37 ℃避光孵育20 min染色；1 000 r/min離心收集細胞，PBS重新懸浮細胞，流式細胞儀檢測線粒體膜電位的改變[6]。

1.2.6細胞周期進程檢測 取對數生長期的K562及K562/G01細胞，不同濃度的FM-Nov17處理48 h；1 000 r/min，5 min收集并洗滌細胞離心；75%冰冷的乙醇-20 ℃固定24 h；1 000 r/min離心5 min，棄去乙醇；含50 μg/mL RNA酶和50 μg/mL PI的PBS重懸細胞，室溫避光孵育30 min，流式細胞儀檢測；結果采用Modifit軟件分析。

1.2.7細胞凋亡率檢測 取對數生長期的K562和K562/G01細胞，不同濃度的FM-Nov17處理48 h，1 000 r/min離心5 min收集和洗滌細胞2次，用分別含有5 μL Annxin V-FITC和5 μL PI 的Binding Buffer避光孵育15 min，流式細胞儀檢測。

1.2.8蛋白免疫印跡 取對數生長期的K562和K562/G01細胞，不同濃度的FM-Nov17處理48 h，裂解細胞提取總蛋白，BCA蛋白定量，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜，封閉，相應一抗過夜孵育，TBST洗滌3次，每次10 min，二抗室溫下孵育1 h，TBST洗滌3次，每次10 min，用ECL超強發光底物在成像系統進行曝光顯影。

2 結 果

2.1FM-Nov17體外抑制K562和K562/G01細胞增殖和減少增殖分裂代數 MTT實驗結果表明,FM-Nov17和Nov都能夠明顯抑制細胞的增殖，FM-Nov17對K562和K562/G01細胞IC50分別為(58.28±0.31)和(62.36±0.14)μmol/L，而Nov對K562和K562/G01細胞IC50分別為(445.60±0.17)和(501.21±0.22)μmol/L(圖1)。

A:FM-Nov17； B：Nov.

不同濃度的FM-Nov17處理K562和K562/G01細胞72 h后， K562和K562/G01細胞的增殖分裂代數減少(圖2)。

2.2FM-Nov17誘導DNA的損傷 FM-Nov17處理細胞后， γ-H2AX發生磷酸化并聚集在DNA損傷處，流式細胞術檢測γ-H2AX百分比增加,并且呈劑量依賴關系。與此同時,凋亡標志Cleaved-Parp的百分比也提高(圖3)。

A:K562細胞；B：K562/G01細胞. a、b分別為FM-Nov17 75,37.5 μmol/L, c:對照組.

A：流式細胞術檢測FM-Nov17誘導K562和K562/G01細胞DNA的損傷；B：FM-Nov17影響K562和K562/G01細胞內γ-H2AX表達；C：FM-Nov17誘導K562和K562/G01細胞內Parp的切割. 1.對照組； 2.FM-Nov17 37.5 μmol/L; 3.FM-Nov17 75 μmol/L. 與對照組比較，☆：P≤0.05；☆☆：P≤0.01；☆☆☆：P≤0.001.

2.3FM-Nov17影響K562和K562/G01細胞線粒體的膜電位 隨著FM-Nov17藥物濃度的增加，JC-1 Red/Green的比值減小，表明FM-Nov17能夠誘導線粒體膜電位的降低(圖4)。

2.4FM-Nov17誘導K562和K562/G01細胞凋亡 不同濃度的FM-Nov17處理K562和K562/G01細胞48 h，PI和Annexin V-FITC雙染流式細胞術檢測細胞凋亡結果表明，隨著FM-Nov17藥物濃度的增加，K562和K562/G01細胞的凋亡率隨之增加(圖5)。

2.5FM-Nov17誘導K562和K562/G01細胞周期G2/M期阻滯 不同濃度的FM-Nov17處理K562和K562/G01細胞48 h，PI染色流式細胞術檢測細胞周期，結果表明，隨著FM-Nov17藥物濃度的增加G2/M期K562和K562/G01細胞比例明顯增加(圖6)。

A：流式細胞術檢測FM-Nov17對線粒體膜電位的影響；B：柱狀圖描述FM-Nov17對線粒體膜電位的影響. 1. 對照組；2. FM-Nov17 37.5 μmol/L；3. FM-Nov17 75 μmol/L. 與對照組比較，☆☆☆：P≤0.0001.

A:流式細胞術檢測FM-Nov17增加K562和K562/G01細胞凋亡；B：柱狀圖定量描述FM-Nov17對細胞凋亡率影響. 1.對照組； 2.FM-Nov17 37.5 μmol/L; 3.FM-Nov17 75 μmol/L. 與對照組比較，☆☆☆：P≤0.001.

2.6FM-Nov17影響K562及K562/G01細胞蛋白表達 不同濃度的FM-Nov17處理K562和K562/G01細胞48 h，蛋白免疫印跡結果表明,Nov能顯著增加γ-H2AX、ATM、p-P53的表達以及Parp和Caspase 3的切割，而降低CDC25A和CDC25C的表達(圖7)。

3 討 論

CML是一種骨髓造血干細胞異常克隆性疾病[7]，以BCR-ABL嵌合染色體為主要特征，BCR-ABL的基因產物為具有酪氨酸激酶活性的P210蛋白。IM是以P210為治療靶點的酪氨酸激酶抑制劑(TKI)[8]，是治療CML的一線藥物，能明顯緩解CML的臨床癥狀，甚至在血液學和遺傳學方面達到完全緩解CML[9]。但IM對于CML急性期和急變期以及BCR-ABL突變的CML患者療效差，并且隨著IM的臨床使用，耐IM的病例不斷增加。解決以上問題的方法大體有兩種：其一，開發新的活性更高的TKI；其二，研發新的、非靶向BCR-ABL的抗腫瘤化合物。

臨床現今常用的放療和化療方法，大多數以誘導腫瘤細胞DNA損傷為機制，細胞遭受DNA損傷時，會激活DNA損傷反應[10]，針對不同的損傷形式，激活不同的修復通路，如細胞受到輕微的DNA單個堿基的損傷便會激活堿基切除修復，當細胞遭受嚴重DNA雙鏈斷裂損傷(DSB)時便激活同源重組(HR)修復或非同源末端鏈接(NHEJ)修復[11]。在細胞出現DSB時，組蛋白γ-H2AX磷酸化聚集到DSB斷裂處，招募其他DNA損傷修復蛋白如ATM、Chk1和Chk2等，ATM磷酸化而活化激活下游信號通路，如磷酸化P53能使抑制P53泛素化降解增強P53蛋白的功能[12]，磷酸化的Chk1和Chk2通過磷酸化P53穩定和增強P53的功能[13]，影響細胞的正常代謝活動甚至激活細胞程序性死亡(細胞凋亡)。P53通過抑制下游的CDC25A和CDC25C的表達，抑制有絲分裂促進因子(MPF)復合物的形成[14]，使細胞不能順利通過G2/M期，誘導細胞周期G2/M期阻滯。P53也可以通過激活Bax介導的線粒體膜電位的降低，使細胞內的細胞色素C釋放，激活Caspase信號通路，促使Parp和Caspase 3切割，使Parp修復功能喪失抑制DNA損傷修復以及激活線粒體凋亡通路，誘導細胞凋亡[15]。

圖6 FM-Nov17影響K562和K562/G01細胞周期進程

圖7 FM-Nov17影響K562和K562/G01細胞內DNA損傷相關蛋白的表達

Nov具有抑制CML細胞的增殖作用，但活性偏低，FM-Nov17是Nov的衍生物，由本課題組合成，通過體外抗腫瘤活性篩選即MTT實驗表明，FM-Nov17也具有明顯的抗CML的增殖作用，其活性比Nov提高了4倍左右。CFSE是一種低毒并能穿透細胞膜的熒光染料，在細胞分裂增殖過程中，標記熒光可平均分配至子代細胞中，熒光強度隨細胞的分裂而降低，可用于檢測細胞增殖，細胞周期的估算及細胞分裂等情況。CFSE實驗表明，FM-Nov17能夠減少CML細胞的增殖代數。進一步研究表明，FM-Nov17能夠誘導CML細胞DNA損傷激活DNA損傷應答反應，增加p53的磷酸化，激活p53介導的細胞周期G2/M期阻滯和細胞凋亡，從而抑制CML的增殖。

綜上所述，新生霉素衍生物FM-Nov17體外具有明顯的抗CML活性，其機制為誘導DNA損傷觸發細胞周期阻滯和細胞凋亡。

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