兩種火炭母基因組DNA提取方法的對比研究

劉靜華

兩種火炭母基因組DNA提取方法的對比研究

劉靜華

（韶關學院英東生命科學學院，廣東韶關512005）

火炭母富含有多酚、多糖等次生代謝產物.這些次生代謝產物對火炭母基因組DNA提取的質量與產量有較大影響.以火炭母的成熟葉片，幼嫩葉片、幼嫩莖尖為實驗材料，采用改良SDS法和CTAB法，對火炭母進行基因組DNA提取，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，紫外分光光度計法測定其濃度和純度，對提取效果進行比較，以期得到提取火炭母基因組DNA的最佳方法.

火炭母；基因組DNA；提取

火炭母為蓼科（Polygonaceae）蓼屬（Polygonum）植物火炭母草（Polygonum chinense Linn.）.別名火炭藤、火炭毛等.性味寒、微酸、澀.具有清熱祛濕、涼血解毒、明目、止癢等功效.用于痢疾、咽喉腫痛、流行性腮腺炎、扁桃腺炎、肝炎等疾病的治療.火炭母對于金黃葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸埃氏菌、痢疾桿菌、枯草桿菌等具有一定的抑菌活性，有較好的藥用價值.而要對火炭母進行分子生物學的研究，首要條件是提取到質量好、產量高的基因組DNA.雖然目前植物DNA的提取純化方法比較成熟，但對不同的植物而言，提取效果相差很大.火炭母全草含多種多酚類物質［1］，如蒽醌、黃酮苷、β-谷甾醇、山奈酚、槲皮素、鞣花酸、3-O-甲基鞣花酸、逆沒食子酸、沒食子酸、山奈酚-7-葡萄糖苷等；多糖類物質如L-肌醇、D-半乳糖醛酸、D-半乳糖、麥芽糖、L-鼠李糖、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸等；非皂化部分含β-谷甾醇等；根和根莖含多種氨基酸.這些多酚類與多糖類物質加大了提取火炭母基因組DNA的難度.本文選擇了改良SDS法［2］和CTAB法［3］，以火炭母的成熟葉片、幼嫩葉片、幼嫩莖尖為實驗材料，進行基因組DNA提取，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，紫外分光光度計法測定其濃度和純度，對提取效果進行比較，以期得到提取火炭母基因組DNA的最佳方法.

1 材料與方法

1.1材料與試劑

野外采集到生長良好、無表觀病變的火炭母全株，保留根部土壤，移至室內培養數天.選取其成熟葉片、幼嫩葉片、幼嫩莖尖作為實驗原材料.

CTAB、SDS、PVP、β－巰基乙醇、Tris·HCl、EDTA、核酸染料購自北京鼎國公司，氯仿、異戊醇、無水乙醇、氯化鈉、醋酸鈉、醋酸鉀均為市售分析純.配制用水為去離子水并經高壓滅菌.

1.2儀器設備

高速冷凍離心機（上海安亭TGL-16G），電泳儀（北京六一儀器廠DYY-11型），電泳槽（北京六一DYC-33A型），紫外可見分光光度計（光譜儀器公司752型），紫外分析儀（北京六一儀器廠WD-9403型），高壓滅菌鍋（上海申安醫療器械廠ZDX-35BI型），恒溫干燥箱（上海申光儀器儀表有限公司200AB-2型），電子分析天平（上海恒平JA5003型）等.

1.3基因組DNA提取方法

實驗采用改良SDS法、CTAB法提取火炭母基因組DNA.每種方法每種樣品進行3次重復.

預處理：將新鮮的火炭母幼嫩葉片、成熟葉片、幼嫩莖尖分別用液氮加PVP干粉研磨成粉末，每種樣品均采用改良SDS法、CTAB法提取其基因組DNA.

CTAB法：準確稱取100 mg植物組織干粉于1.5 ml離心管中，加入500μL 65℃的CTAB提取液（2% CTAB，3%可溶性PVP，2%β-巰基乙醇，100 mmol·L-1Tris·HCl pH8.0，25 mmol·L-1EDTA pH8.0）充分混勻，65℃保溫30 min，降至室溫后加入等體積氯仿/異戊醇（24∶1），溫和顛倒混勻，4℃，12 000 rpm離心15 min，取上清于另一離心管，加入兩倍體積的無水乙醇，輕混勻，靜置10 min,有白色絮狀沉淀出現，4℃，10 000 rpm離心5 min，棄上清，70%乙醇洗滌沉淀2次，乙醇徹底干燥后沉淀溶于50μLTE緩沖液中，4℃保存.

改良SDS法：準確稱取100 mg植物組織干粉于1.5 mL離心管中，加入500μL預冷的提取液（3%可溶性PVP，2%β-巰基乙醇，50 mmol·L-1Tris·HCl pH8.0，50 mmol·L-1EDTA pH8.0）充分混勻，冰上放置10 min后，4℃，6 000 rpm離心5 min，棄上清.再次加入500μL上述提取液重懸沉底，離心后棄上清，沉淀中加入500μl 65℃預熱的裂解緩沖液（15%SDS，100 mmol·L-1Tris·HCl pH8.0，20 mmol·L-1EDTA pH8.0，500 mmol·L-1NaCl）顛倒混勻，65℃保溫45 min，期間不時顛倒混勻，降至室溫后加入等體積氯仿/異戊醇（24: 1），顛倒混勻.4℃，10 000 rpm離心10 min，取上清，加入0.1（v/v）5 mol·L-1KAc（pH4.8）,加入等體積-20℃預冷的異丙醇.-20℃靜置30 min后,4℃，12 000 rpm離心20 min，70%乙醇洗滌2次，乙醇徹底干燥后沉淀溶于50μlTE緩沖液中，4℃保存.

1.4DNA完整性檢測

取5μL DNA樣品按6×loadingbuffer的比例混合，點入含0.5μg·mL-1核酸染料的1.0%瓊脂糖凝膠中，1×TBE中5 v/cm穩壓電泳50 min后，在紫外檢測儀上觀察.

1.5DNA純度和濃度檢測［4］

吸取5μL DNA樣品，加TE緩沖液至1 mL混勻，測定OD260 nm和OD280 nm，取得紫外線吸收值的比值（OD260/OD280）；DNA濃度的計算公式：雙鏈DNA濃度（μg·μL-1）=OD260×樣品稀釋倍數×50/1 000.

2 結果與分析

2.1電泳實驗

用2種方法提取幼嫩葉片、成熟葉片、幼嫩莖尖的DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳結果如圖1.

圖1 2種提取方法的DNA電泳圖

如圖1所示，6個DNA條帶均較明亮、整齊，無明顯拖尾現象，說明6個樣品液中的DNA片段比較完整，多酚類次生代謝產物去除得比較干凈，并且無RNA殘留.但樣品1、2、3的點樣孔附近有微弱的亮帶，說明此3種樣品液中殘留少量蛋白質；樣品4、5、6點樣孔附近無明顯亮帶出現，說明此3種樣品液中蛋白質去除干凈.另外，CTAB法的DNA條帶更粗更亮，說明樣品液中DNA含量更高.SDS法的DNA泳道有隱約的拖尾現象，可能是由于SDS十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate）作為離子型表面活性劑，在55℃～65℃條件下，能夠溶解細胞膜及核膜蛋白，使核蛋白解聚，從而使染色體DNA離析.但此過程反應比較劇烈，可能會使大分子DNA發生斷裂，因此提取物中含少量小片段DNA；或者可能是由于操作過程中核酸酶未徹底清除.而CTAB作為一種陽離子去污劑，能與核酸形成復合物，在低鹽溶液（NaCl濃度＜0.3 mol·L-1）中，此復合物會因溶解度的降低而沉淀，而在高鹽濃度（NaCl濃度＜0.7 mol·L-1）中會解離，從而使DNA分子與蛋白質和多糖分開.在經酚、氯仿、異戊醇抽提去除蛋白質，最后用乙醇沉淀DNA.由于CTAB-核酸復合物的形成能較好地保護大分子DNA，所以CTAB法的DNA泳道沒有拖尾現象.

電泳結果反映CTAB法提取的火炭母葉片基因組DNA的純度和含量都高于改良SDS法.

2.2紫外分光光度計檢測

紫外分光光度計檢測吸光度及相應處理結果如表1所示.

表1 2種提取方法的DNA吸光度檢測結果

由于核酸分子含有的嘌呤環及嘧啶環的共價雙鍵，在260 nm波長有特異的吸收峰，其吸光度與核酸的濃度成正比.OD260相當于dsDNA 50μg·mL-1，ssDNA 33μg·mL-1和ssRNA 40μg·mL-1.可以此來計算核酸樣品的濃度.紫外分光光度法不但能確定核酸的濃度，還可通過測定260 nm和280 nm的紫外線吸收值的比值（OD260/OD280）估計核酸的純度，純的DNA制品的比值為1.8，RNA的比值為2.0，若DNA高于1.8，則可能有RNA污染，低于1.8則有蛋白質和酚污染.

如表1所示，改良SDS法提取火炭母幼嫩葉片DNA的平均OD260/OD280比值為1.739，成熟葉片為1.720均低于1.8，說明有酚類和蛋白質的污染，可能由于火炭母葉片的成熟程度影響了DNA提取的質量.新生組織的次生代謝產物比較少，成熟葉片的酚類、多糖等次生產物含量較高.但幼嫩莖尖DNA比值為1.841接近1.8，說明純度較好，可能是由于莖尖的次生代謝產物含量較少，正處于細胞分裂旺盛的幼嫩莖尖DNA含量更高.而CTAB法提取火炭母幼嫩葉片DNA的平均OD260/OD280比值為1.843，成熟葉片的為1.827，幼嫩莖尖的為1.817，接近1.8，表示DNA污染少，純度高，說明CTAB法提取火炭母DNA時去除蛋白質、次生代謝產物的效果優于改良SDS法.

根據OD260nm計算DNA濃度，改良SDS法提取火炭母幼嫩葉片DNA平均濃度為1.224μg·μL-1，成熟葉片的為1.130μg·μL-1，幼嫩莖尖的為1.381μg·μL-1.CTAB法提取火炭母幼嫩葉片DNA平均濃度為1.569μg·μL-1，成熟葉片的為1.473μg·μL-1，幼嫩莖尖的為1.588μg·μL-1.說明CTAB法提取火炭母DNA的效率高于改良SDS法.

3 結論

植物DNA提取方法很多，不同植物，甚至是同一類植物，但組織材料的來源、部位、形態等外在性質的不同以及化學成分、次生產物，組織結構等內在特點的差異，在提取基因組DNA時選用的方法都有不同.本文的實驗表明火炭母基因組DNA提取用CTAB法優于改良SDS法.

火炭母葉片富含酚類及多糖等次生代謝產物.幼嫩莖尖不僅細胞分裂旺盛、DNA含量高，而且酚類和多糖含量較少，提取DNA效果較好，但由于莖尖數量少取材較難.幼嫩葉片數量較多，次生產物也較少，是提取火炭母DNA的理想材料.DNA提取過程操作的關鍵：使用的研缽、槍頭、藥勺、離心管要經過嚴格的滅菌.操作要在低溫環境中進行，盡量防止內源Dnase和外界雜質的干擾.操作要溫和，研磨時要快速且用力適當，避免破壞DNA分子.

兩種提取DNA的方法在液氮研磨及提取緩沖液中都加入了PVP（聚乙烯吡咯烷酮），PVP能與多酚類結合成復合物，防止多酚氧化褐變，并能去除多糖；而β-巰基乙醇作為強還原劑能打斷多酚氧化酶的二硫鍵而使之失活，以防止多酚的氧化.二者同用，有效地抑制多酚類物質對DNA的影響，提高提取DNA的純度.對于如火炭母一類次生產物中酚類與多糖含量較高的植物，提取DNA時，可加入1%～6%的PVP，同時抽提液中使用巰基乙醇來抑制氧化作用.

［1］謝賢強，吳萍.火炭母化學成分的研究［J］.熱帶亞熱帶植物學報，2007,15（5）：450-454.

［2］丁芳林，彭書練.黃芩高質量DNA提取方法研究［J］.湖南農業科學，2010（13）：23-25.

［3］楊松杰.藥用絞股藍屬植物基因組DNA提取方法比較［J］.陜西農業科學，2013（1）：87-89.

［4］高洪曉，楊凱.3種植物DNA提取法中多糖類物質去除效果的研究［J］.北京農學院學報，2011，26(1)：70-72.

Study on two DNA extraction methods of Polygonum chinense Linn

LIU Jing-hua
（Yingdong College of Bioscience，Shaoguan University，Shaoguan 512005，Guangdong，China）

Polygonum chinense Linn contains rich polyphenols polysaccharide secondary metabolites,which influences greatly the quality and quantity of its DNA extraction.Taking the mature leaves,the young leaves and young stem tip as the raw materials of the experiment,and adopting the method of improved SDS and CTAB,a better way is made to extract the DNA of Polygonum chinense Linn,whose complicity has been detected by agarose gel electrophoresis and density and purity by ultraviolet spectrophotometer method.

Polygonum chinense Linn;genome DNA;extraction

（責任編輯：邵曉軍）

Q93-33

A

1007-5348（2014）04-0056-04

2014-01-18

劉靜華（1980-），女，廣東龍川人，韶關學院英東生命科學學院實驗師，主要從事分子生物學、基因工程方面的研究.