促進草莓炭疽病菌大量產孢的方法

黃軍凱， 張國珍

（中國農業大學植物病理學系，農業部植物病理學重點實驗室，北京 100193）

炭疽菌屬（Colletotrichu m）真菌寄主范圍廣泛，可以危害果樹、農作物和花卉等［1－2］，引起多種植物的炭疽病。草莓炭疽病主要危害果實、根莖、葉片、匍匐莖、葉柄、花等，可導致果腐、根莖腐爛及整株萎蔫死亡、葉片、匍匐莖和葉柄的斑病及花枯［3］。以往報道，引起草莓炭疽病的病原菌主要有草莓炭疽菌（Colletotrichu m f r agariae）、膠 孢 炭 疽 菌 （C．gl oeosporioides）和尖孢炭疽菌（C．acutatu m）［3］。實際上，過去傳統意義上的膠孢炭疽菌和尖孢炭疽菌均為復合種，每一復合種內包含有多個種［4］。本實驗室利用多基因系統發育分析的方法，對引起草莓炭疽病的病原菌進行了種的鑒定，發現國內草莓炭疽病菌的優勢種為Colletotrichum theobromicol a（原來稱為Colletotrichum f r agariae）（結果待發表）。

誘導真菌產生分生孢子是植物病原學研究、植物抗病性鑒定等工作中的重要環節。常規誘導分生孢子產生的方法有菌絲涂斷、近紫外光照射、采用不同培養基或在培養基中添加植物組織、某種營養成分等［5－7］。

近年來隨著草莓種植面積的擴大和種植年限的增加以及某些感病品種的推廣，草莓炭疽病的發生在國內日趨嚴重［8］，科研單位和育種部門正加快草莓抗炭疽病的品種選育。如何通過人工培養，快速、大量獲得炭疽病菌的分生孢子是獲得有效接種體的重要保證。我們在進行草莓炭疽病菌的研究中，發現有些炭疽菌的菌株在PDA培養基上產孢少或產孢比較慢。在篩選草莓炭疽病菌的生防菌的過程中，把濾掉細菌的LB培養液添加到PDA培養基中，發現對炭疽菌分生孢子的產生有促進作用。為此，我們通過試驗分析了LB培養基的主要成分中，究竟是酵母提取物還是胰蛋白胨對炭疽菌的產孢有促進作用，并確定了促進產孢成分的最佳用量。同時，還測定了涂斷菌絲的方法是否對炭疽菌有促進產孢的作用。試驗結果可為快速獲得草莓炭疽病菌的大量分生孢子提供簡便易行的方法和培養基。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

試驗所用菌株分離自北京地區草莓炭疽病病樣的根莖，經本實驗室鑒定為C．theobromicol a，是草莓炭疽病菌中的優勢種，所用菌株為C36。

1．2 培養基

LB培養基：胰蛋白胨（T）10 g，酵母提取物（YE）5 g，NaCl 10 g，瓊脂15 g，加水定容至1 L，用Na OH調節p H至7．4。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 L。

PDA＋10%LB：1 L PDA培養基加入100 mL LB培養液。

PDA＋0．1%T：1 L PDA培養基加入1 g胰蛋白胨。

PDA＋0．05%YE、PDA＋0．1%YE和PDA＋0．5%YE：1 L PDA培養基分別加入0．5、1和5 g酵母提取物。

各培養基121℃滅菌20 min，備用。

1．3 試驗方法

1．3．1 培養基對炭疽病菌生長的影響

將炭疽病菌菌株C36在PDA培養基上培養，待菌落長至培養皿近邊緣時用打孔器（直徑4 mm）在菌落邊緣打取菌餅，分別接種到上述（1．2培養基）不同培養基平板（直徑6 c m）中央，28℃，14 h光照條件下培養。培養3 d后測量菌落直徑，觀察并比較炭疽菌在不同培養基上的菌落特征和生長速度。以PDA培養基為對照。每處理重復3皿。

1．3．2 培養基對炭疽病菌產孢的影響

接菌方法和培養條件同1．3．1。培養5 d后，將整皿的分生孢子洗下，稀釋成合適的孢子濃度，用血球計數板計數，并計算單位菌落面積的產孢量。以PDA培養基為對照。每處理重復3皿。

1．3．3 涂斷氣生菌絲對炭疽病菌分生孢子產生的影響

菌落生長3 d后，用無菌棉簽將菌落上的氣生菌絲涂斷，繼續培養2 d，洗下整皿的分生孢子，計數方法同1．3．2，以不涂斷的處理為對照。每處理重復3皿。

1．4 數據處理

采用SPSS 17．0軟件和Office Excel 2007軟件對試驗所得數據進行處理與分析。

2 結果與分析

2．1 PDA中添加LB培養液及其主要成分對炭疽病菌生長和產孢的影響

在前期的其他試驗中，我們偶然發現PDA培養基中添加一定量的LB培養液對草莓炭疽病菌有促進產孢的作用，為了明確LB培養液以及其中的哪種主要成分能夠促進產孢，試驗分別設置PDA中添加10%LB培養液、0．1%胰蛋白胨和0．05%酵母提取物，測定不同培養基對炭疽病菌生長和產孢的影響。

2．1．1 對菌落生長速度和菌落形態的影響

PDA培養基中添加10%LB培養液對菌落生長速度有一定影響，與對照相比菌落生長有所減慢，添加0．1%胰蛋白胨和0．05%酵母提取物對菌落生長速度均無顯著影響（表1）。但從菌落特征來看，添加LB和酵母提取物處理的菌落中央出現較明顯的肉粉色的產孢區（圖1b），添加胰蛋白胨的則不明顯，說明添加LB培養液促進產孢可能主要是酵母提取物的作用。

表1 PDA培養基中添加LB、胰蛋白胨和酵母提取物對草莓炭疽病菌C36菌落生長速度的影響（3 d）1）Table 1 Effects of LB，tryptone and yeast extract added in PDA media on colonial growth rate of C．theobromicola C36（3 d）

圖1 C．theobromicola C36在添加LB、胰蛋白胨和酵母提取物的PDA培養基上的菌落特征（3 d）Fig．1 The colonies of C．theobromicola C36 on PDA media with LB，tr yptone and yeast extract，respectively（3 d）

2．1．2 對產孢量的影響

在PDA培養基中分別添加10%LB培養液和0．05%酵母提取物，培養3 d的菌株產孢量分別為15．51×104個／c m2和17．67×104個／c m2（圖2），分別是對照產孢量的5．8倍和6．6倍。雖然添加胰蛋白胨的產孢量也高于對照，但明顯低于添加酵母提取物的處理。結果表明，PDA中添加LB培養液促進炭疽病菌產孢，主要是酵母提取物的作用。

圖2 PDA培養基中添加LB、胰蛋白胨和酵母提取物對C．theobromicola C36產孢量的影響（3 d）（P＜0．05）Fig．2 Effects of LB，tryptone and yeast extract added in PDA media on sporulation of C．theobro micol a C36（3 d）（P＜0．05）

2．2 酵母提取物添加量對炭疽病菌生長和產孢的影響

為了進一步確定促進分生孢子產生的酵母提取物的最適添加量，在上述添加0．05%酵母提取物的基礎上，又分別設置了0．1%和0．5% 兩個用量。

2．2．1 對菌落形態、菌落生長速度的影響

在PDA培養基中分別添加0．05%、0．1%和0．5%酵母提取物的3個添加量中，隨著酵母提取物添加量的增加，菌落生長速度有所減慢（表2），說明酵母提取物的濃度超過0．05%對菌落生長有一定抑制作用。隨酵母提取物濃度的增加，菌落顏色變白，添加量為0．1%時菌落中央的肉粉色產孢區更明顯，而添加量增加到0．5%時產孢區反而減小（圖3）。因此，添加0．1%酵母提取物最有利于C．theobromicola的產孢。

表2 PDA培養基中酵母提取物添加量對C．theobromicola C36菌落生長速度的影響（3 d）（P＜0．05）Table 2 Effects of the contents of yeast extract added in PDA media on colonial growth rate of C．theobromicola C36（3 d）（P＜0．05）

圖3 C．theobr omicola C36在添加不同量酵母提取物的PDA培養基上的菌落特征（3 d）Fig．3 Colonies of C．theobr omicola C36 on PDA media with different contents of yeast extr act（3 d）

2．2．2 對產孢量的影響

在PDA培養基中分別添加0．05%、0．1%和0．5%酵母提取物的3個添加量中，以添加0．1%酵母提取物的產孢量最高，為42．41×104個／c m2（圖4），表明PDA培養基中添加0．1%酵母提取物最有利于C．theobromicol a的分生孢子產生。

圖4 PDA培養基中添加不同量的酵母提取物對C．theobr omicola C36產孢量的影響（3 d）（P＜0．05）Fig．4 Effects of different contents of yeast extract added in PDA media on spor ulation of C．theobr omicola

2．3 涂斷菌絲對C．theobromicola產孢量的影響

菌株C36在培養基上培養3 d時，用無菌棉簽將菌落表面的氣生菌絲全部擦掉，再繼續培養2 d后，可見培養基表面氣生菌絲很少，布滿一層肉粉色分生孢子（圖5b1～b4），而在培養基上生長5 d未涂斷菌絲的菌落氣生菌絲茂密，只在菌落中央區域有產孢（圖5a2～a4）。從圖5還可以看出，不論是涂斷還是未涂斷菌絲的處理，添加酵母提取物后均比對照PDA培養基上的產孢區明顯。

涂斷菌絲后，在添加不同量酵母提取物的培養基上的產孢量都較未涂斷菌絲的顯著提高。在添加0．1%酵母提取物的培養基上未涂斷菌絲的產孢量為57．91×104個／c m2，涂斷菌絲后產孢量達101．24×104個／c m2，為前者的1．75倍；在添加0．5%酵母提取物的培養基上未涂斷菌絲的產孢量為32．58×104個／c m2，涂斷菌絲后產孢量達143．90×104個／cm2，為前者的4倍（圖6）。試驗結果也進一步印證了所觀察到的肉粉色產孢區域大小和濃密與產孢多少直接相關，肉粉色區域越濃密，產孢量越大。由此可見，在PDA培養基中添加酵母提取物并結合菌絲涂斷處理可使產孢量大大提高。

圖5 未涂斷菌絲培養5 d（a）與涂斷菌絲2 d后（b）C．theobr omicola C36的菌落特征Fig．5 Colonies of C．theobr omicol a C36 gr owing 5 days with un－er ased aerial mycelia（a）and 2 days after the aerial mycelia erased（b）

未涂斷菌絲的處理中，對照圖4和圖6中的結果，發現隨培養時間的延長炭疽菌的產孢量有所增加，添加不同量的酵母提取物對產孢的影響是一致的，均為添加0．1%酵母提取物的產孢量最高。涂斷菌絲的處理中，添加0．5%酵母提取物處理的產孢量最高，為143．90×104個／c m2，與未涂斷菌絲的處理不完全一致，有可能與培養時間延長2 d或菌絲涂斷作用有關。

圖6 菌絲涂斷處理對C．theobromicol a C36產孢量的影響（5 d）（P＜0．05）Fig．6 Effects of erasing aerial mycelia on sporulation of C．theobromicola C36（5 d）（P＜0．05）

3 小結與討論

炭疽菌的人工培養通常采用PDA培養基，一般需要培養7 d左右才能產孢，產孢量也較少。本試驗中，在PDA中添加0．1%的酵母提取物即可在培養3 d時得到大量的分生孢子，如果再結合涂斷菌絲的方法繼續培養2 d后，可使產孢量再提高2倍以上。本試驗中誘發草莓炭疽病菌大量產孢的方法，將病原菌產孢對某種營養成分的需求與涂斷菌絲刺激病原菌產孢兩種方式結合起來，與以往報道的其他方法［5－7］有所不同。該方法對于草莓上其他種的炭疽菌也是適用的（數據未列出）。

據我們近幾年對草莓病害的調查發現，在設施栽培草莓上，炭疽病的危害主要表現在定植期引起植株的枯萎死苗，造成嚴重缺苗和毀苗，損失嚴重。因此，加強對草莓炭疽病的抗病育種非常必要。而進行抗病品種的選育需要人工培養炭疽菌，以分生孢子作為接種體［8］。本試驗發現的促進炭疽菌的產孢方法，培養3～5 d便可獲得大量的分生孢子作為接種體使用。本研究中所用培養基的營養成分簡單，促進產孢的操作簡便，獲得的分生孢子新鮮，菌齡一致，且產孢量大，非常適合相關科研單位進行抗病性鑒定時使用。

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