四川省茂縣花椒根結線蟲病病原鑒定

王曦茁， 汪來發＊， 楊佐忠， 劉子雄， 余明忠

（1．中國林業科學研究院森林生態與保護研究所，國家林業局森林保護學重點實驗室，北京 100091；2．四川省森林病蟲害防治檢疫站，成都 610081；3．四川省茂縣林業局，茂縣 623200）

花椒（Zanthoxyl u m bungeanu m Maxi m）為蕓香科花椒屬落葉小喬木或灌木，原產于我國，是重要的木本油料和香料樹種，因適應性強，分布廣和收益大，深受群眾歡迎［1］。我國自1999年實行退耕還林工程以來，四川省在退耕地大力種植花椒，目前已成為許多地區農業支柱產業和高半山農民增收致富的主要途徑之一。2005年以來，四川阿壩州茂縣部分鄉鎮的花椒幼樹植株矮小，葉片發黃、失綠，生長緩慢，最后植株枯死，嚴重地塊死亡率達到30%～50%。花椒根及根尖處形成許多小米粒或綠豆粒大小形狀不規則的根結，隨后側根也出現大小不等、表面粗糙的形狀不規則根結，表面為褐色至深褐色，根結表面又長出許多細的分枝須根，單株根結有的多達百個以上，主要分布在0～30 c m土層。剖開根結見有白色梨形雌蟲，即花椒樹感染了根結線蟲。我國學者雖對花椒病害進行了廣泛的研究［2］，僅有一位學者提及花椒苗感染南方根結線蟲［Mel oidogyne incognita （Kof oid ＆ White）Chit wood］［3］，至今未見花椒根結線蟲病的詳細報道。隨著經濟發展，作為茂縣的支柱產業，茂縣的花椒栽植面積在不斷擴大，根結線蟲病造成的經濟損失也在逐年增加，為了明確茂縣花椒根結線蟲病的病原種類，在2011年4月－9月間，筆者采集四川茂縣影響嚴重的花椒根結線蟲樣品，通過花椒根結線蟲形態觀察測量、雌成蟲會陰花紋、同工酶的酯酶譜帶特征和分子生物學特征分析，明確了該縣花椒根結線蟲病的病原種類，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1．1 花椒根結線蟲的采集

在四川省茂縣白溪鄉和疊溪鎮花椒種植區采集感病花椒樣品，使用隨機取樣法，采集長有根結的根及其周圍的病土，病土采自土壤表層5～30 c m處，每個地塊隨機采5個點，混勻后放入同一個采集袋內，做好標記。將采集的標樣帶回實驗室，以單卵塊接種在滅菌土中培養的剛長出兩片真葉的易感病番茄幼苗的土中，培養2個月，用于后期鑒定［4］。

1．2 花椒根結線蟲的獲得

雌蟲的分離和收集：單卵塊繁殖60 d后，取被侵染的番茄根，在體視顯微鏡下將根結表皮用鑷子或針尖輕輕撥開，剖面上乳白色的光滑球狀物即為根結線蟲的雌蟲，用解剖針輕輕撥出，放入水中待用。

2齡幼蟲的收集：單卵塊繁殖60 d后，采集被侵染的番茄根清水洗凈，剪成3 c m小段，裝入500 mL三角瓶中，配制體積分數1%次氯酸鈉溶液，在上述三角瓶中倒入200～300 mL次氯酸鈉溶液，封口后猛搖3 min，立即用蒸餾水沖洗數次，先后過200目和500目篩，用蒸餾水反復沖洗留在500目篩子上的卵，最后用無菌水沖洗收集于無菌的小燒杯中。將上述卵放于26℃無菌培養箱中孵化3 d，得到根結線蟲的2齡幼蟲。

1．3 形態學鑒定

1．3．1 雌蟲主要形態特征觀察測量

觀察頭部特征、口針特征等。測量20條線蟲體長、最大體寬、口針長和DEGO（背食道腺開口至口針基部球的距離）等形態指標。

1．3．2 2齡幼蟲主要形態特征觀察測量

觀察頭部特征、尾部特征等。共觀測20條線蟲。主要測計的指標為體長、最大體寬、口針長、DEGO和尾長。

1．3．3 雌蟲會陰花紋的制作和觀察

在體視顯微鏡下解剖根結，挑取成熟雌蟲20條。將雌蟲移入硬塑料板上的一滴體積分數45%乳酸中，用解剖刀切取下尾端（蟲體后部約1／4處），將尾端的體內組織去掉，切除尾端表皮多余的部分，僅留下會陰花紋部分。將會陰花紋轉移至一塊載玻片上的純甘油滴中，一個玻片上放10塊會陰花紋，以AFG液為浮載劑，用樹脂封片，制成永久玻片。在顯微鏡下觀察會陰花紋的形態特征并拍照。

1．4 同工酶分析

取5μL浸提液（20%蔗糖＋2%Triton X－100）移至自制研磨管中，解剖鏡下分離一個剛開始產卵的雌蟲，轉入管內浸提液中，用自制的圓頭磨面小玻璃棒充分研磨，補加10μL浸提液。至－20℃冷凍保存。參考Esbenshade和Triantaphyllou等的方法應用垂直板聚丙烯凝膠電泳做酯酶分析［5］。聚丙烯酰胺濃度分別為2．5%和7．5%。凝膠板大小為150 mm×120 mm，凝膠厚度1．5 mm，電極緩沖液是p H 8．3的Tris－鹽酸緩沖液。每孔加樣量為20μL（含濃度為1 mg／mL溴酚藍溶液），電泳前30 min電壓設在80 V，之后將其穩定在190 V，電泳進行約2 h，直到溴酚藍指示條帶遷移距離達到10 c m。酯酶染色參照胡凱基方法［6］。顯色完全后蒸餾水漂洗3次，在固定液（10%醋酸＋10%甘油）中固定3 h以上，酯酶表型的命名參照Esbenshade和Triantaphyllou等［5］的標準，以已鑒定的北方根結線蟲（M．hapl a）樣本（中國農業大學賈克功教授提供）作為參照系判讀酯酶譜型，初步確定根結線蟲的種類，每個樣品做3個重復。

1．5 分子生物學鑒定

1．5．1 根結線蟲DNA提取

在解剖鏡下從組織內挑取1頭雌蟲置于載玻片上，無菌水沖洗3次，滴10μL預冷的線蟲裂解液（10 mmol／L Tris－HCl p H 8．0，1 mmol／L EDTA p H 8．0，0．25 mol／L NaCl，1%SDS）在蟲體上，用槍頭壓碎后從載玻片上吸取盡可能多含線蟲物質的裂解液放入預先裝有10μL無菌水的離心管中，加入2μL的1 mg／mL蛋白酶K并快速加入液氮中冷凍10 min，65℃水浴1 h，95℃水浴10 min使蛋白酶K變性，產物直接用于PCR擴增或者－20℃保存備用。

1．5．2 PCR擴增

r DNA－ITS區擴增采用的通用引物為V5367（5′－TTG ATT ACG TCC CTG CCC TTT－3′）和26S（5′－TTT CAC TCG CCG TTA CTA AGG－3′）［7］；r DNA－IGS區擴增采用的通用引物為5S（5′－TTA ACT TGC CAG ATC GGA CG－3′）和18S（5′－TCT AAT GAG CCG TAC GC－3′）［8］。引物由北京賽百盛基因技術有限公司合成。

PCR體系（25μL）包括模板DNA 4μL，10×PCR buffer（Mg2＋）2．5μL，d NTPs（2．5 mmol／L）2μL，上 游 引 物 （10μmol／L）1μL，下 游 引 物（10μmol／L）1μL，Taq DNA 聚 合 酶 （5 U／μL）0．2μL，加 H2O至25μL。r DNA－ITS區反應條件為：94℃預變性4 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，循環35次；72℃延伸10 min，4℃保存。IGS區反應條件為：94℃預變性3 min；94℃30 s，53℃30 s，72℃90 s，循環45次；72℃延伸10 min，4℃保存。取5μL PCR產物采用1．2%瓊脂糖凝膠120 V電泳30 min進行檢測。

1．5．3 PCR產物的回收

PCR產物由DNA膠回收試劑盒（Ta Ka Ra）回收、純化，具體操作步驟參照試劑盒操作說明。

1．5．4 PCR產物的克隆、測序及數據分析

將純化后的PCR產物克隆至質粒載體p MD18－T（Ta Ka Ra）上，選取每種群各3個陽性克隆由Invitrogen公司測序。利用NCBI BLAST工具和DNA MAN 5．0軟件，將獲得的r DNA－ITS區和r DNA－IGS區序列與Gen Bank已登錄的根結線蟲序列進行比對分析。利用Mega5．0軟件通過最大似然法（maxi mu m likelihood）構建系統發育樹，采用Ki mura t wo－parameter模型。同時對構建的系統樹作自展檢驗（bootstrap test）以獲得分支的支持率，自展檢驗中重復抽樣次數為1000次，以秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）（X03680）的ITS和IGS序列作為外群。

2 結果與分析

2．1 根結線蟲形態學鑒定

雌蟲：體白色，梨形，頸短，頭區大，無環紋，口針纖細，基球圓形和桿部有明顯界線。錐部向背部稍稍彎曲，桿部末端最寬。

2齡幼蟲：蠕蟲狀，頭不突出，無縊縮，口針基部球圓形。尾部有明顯透明區，尖端狹窄。

通過對會陰花紋觀察，會陰花紋為近圓的六邊形到卵圓形，背弓扁平或波浪形，側線不明顯，線紋平滑到波浪形，尾端區通常有刻點（圖1）。

雌蟲和2齡幼蟲的部分測量值見表1。參照文獻［9－10］，初步確定花椒根結線蟲為北方根結線蟲（M．hapl a）。

圖1 花椒根結線蟲的會陰花紋Fig．1 The perineal patter n of the pepper root－knot nematode

表1 花椒根結線蟲雌蟲和2齡幼蟲的測量值1）Table 1 Measurementof females and second－stage juveniles of the pepper root－knot nematode

2．2 酯酶同工酶酶譜

將分離純化的根結線蟲種群進行同工酶分析，電泳結果顯示分離純化的種群根結線蟲雌成蟲的酯酶同工酶譜均出現一條酯酶帶，酯酶譜帶類型為H1，遷移率為0．5（圖2），這與已知的北方根結線蟲酯酶同工酶譜相同［5］，因此可以斷定侵染花椒的根結線蟲為北方根結線蟲單一種群（M．hapl a）。

2．3 分子生物學特征

2．3．1 PCR擴增及重組質粒DNA酶切鑒定

通過通用引物對花椒根結線蟲的r DNA－ITS區和r DNA－IGS區進行PCR擴增，片段長度在770 bp左右（圖3），同北方根結線蟲的序列長度基本一致。重組質粒經酶切后都得到1個目的片段大小相似的片段（圖3），這說明質粒為目的片段PCR擴增產物的重組克隆。

圖2 花椒根結線蟲酯酶電泳譜型Fig．2 Phenotype of ester ase isozy me（Est）of the pepper root－knot nematode

圖3 花椒根結線蟲ITS區和IGS區的PCR擴增及產物重組質粒的酶切鑒定結果Fig．3 The PCR identification results of the pepper root－knot nematode ITS and IGS fr agments

2．3．2 序列分析及同源性結果比較

測序結果表明，r DNA－ITS區目的片段長度為768 bp，其 中 ITS1－5．8S－ITS2 區 序 列 長 度 為477 bp，在Gen Bank中進行BLAST和DNA MAN 6．0比對分析，發現ITS1－5．8S－ITS2區序列與北方根結線蟲（AY268108、AY281854和JX024147）序列只有1個堿基差異，序列相似性為99．79%；r DNAIGS區目的片段長度為768 bp，其中IGS2區序列長度為562 bp，與在美國分離獲得北方根結線蟲HI種群（AY528418）只有2個堿基差異，序列相似性為99．64%。將本研究中獲得ITS和IGS序列與Gen－Bank中下載的已知根結線蟲序列進行比對分析，用Maxi mu m likelihood法分別構建了系統發育樹：圖4為基于ITS序列構建的根結線蟲系統發育樹，花椒根結線蟲與北方根結線蟲位于同一大分支，支持率為98%，從樹的分支狀況來看，4種根結線蟲可分為兩組，第Ⅰ組包括所有的北方根結線蟲，第Ⅱ組包括南方根結線蟲、花生根結線蟲和爪哇根結線蟲。組間相隔較遠，分支間的支持率大于98%，系統發育關系比較清晰。圖5為基于IGS序列構建的根結線蟲系統發育樹，花椒根結線蟲與北方根結線蟲位于同一大分支，支持率為98%；與基于ITS序列的系統發育樹相對應，常見的4種根結線蟲也可分為兩組：第Ⅰ組包括所有的北方根結線蟲，而其他3種根結線蟲全部位于Ⅱ組，組間相隔較遠，兩個大分支間支持率大于98%，北方根結線蟲所在分支與南方根結線蟲、花生根結線蟲和爪哇根結線蟲形成的分支間系統發育關系清晰，說明花椒根結線蟲為北方根結線蟲。

3 結論與討論

由于寄主和環境等因素的影響，根結線蟲種內和種間的形態常常有較大的變化，因此，單純依賴一種方法鑒定很難做到快速、準確。應用r DNA－ITS和r RNA－IGS克隆、序列測定分析及比對，已成功地應用于根結線蟲的鑒定［11－12］。本文根據花椒根結線蟲雌蟲和2齡幼蟲的形態特征及雌成蟲的會陰花紋，雌蟲酯酶同工酶分析及分子生物學的檢測（r DNA－ITS區和r RNA－IGS區），結果表明四川茂縣地區花椒根結線蟲的病原為北方根結線蟲。在鑒定中，采用形態學、生物化學和分子生物學特征分析進行綜合鑒定的方法，從而避免了用一種方法鑒定可能出現的誤差。這是首次報道北方根結線蟲引起的花椒新病害，同時也是首次報道北方根結線蟲在我國四川省的分布。

近些年來的調查發現，花椒根結線蟲病的發生在逐步擴展，但因為其危害具有隱蔽性，還未被關注和引起足夠重視。茂縣位于四川省西北部，阿壩藏族羌族自治州的東南緣，是岷江上游的高山峽谷地帶。許多花椒栽植在退耕地及半高山坡上，海拔在1 500～2 000 m，冬冷夏涼、晝夜溫差大、7月平均溫度20．9℃，低于北方根結線蟲分布南限溫度（7月份平均溫度為26．7℃）［13］，因此在這樣的生態環境下，北方根結線蟲是可以生存的。在以前的報道中，四川省危害植物的根結線蟲為常見的南方根結線蟲（M．incognita）、爪哇根結線蟲（M．j avanica）和花生根結線蟲（M．arenaria）等［14］，未見北方根結線蟲的報道，北方根結線蟲是由于苗木運輸傳進四川，還是原已存在，還有待進一步的研究。

圖4 根結線蟲不同種群ITS序列的聚類分析（NJ）Fig．4 NJ tree of 16 Meloidogyne isolates based on ITS sequences of M．hapla

圖5 根結線蟲不同種群IGS序列的聚類分析（Maxi mum likelihood）Fig．5 Maxi mu m likelihood tree of 12 Meloidogyne isolates based on IGS sequences

根據根結線蟲病害發生和流行的特點，目前花椒根結線蟲病的發生范圍仍很有限，建議建立無病種苗生產基地和進行植物檢疫，發病區內種苗不得運輸或攜帶到非發病區種植；選用無病地塊的健壯、無病種苗；對已感病的苗木實行就地銷毀；清除植株病殘體及附近雜草，控制該病的擴展蔓延。

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