電子鼻技術(shù)在 區(qū)分 酸羊奶發(fā)酵菌種中的應(yīng)用

楊春杰，丁 武*，馬利杰

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

電子鼻技術(shù)在 區(qū)分 酸羊奶發(fā)酵菌種中的應(yīng)用

楊春杰，丁 武*，馬利杰

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

利用電子鼻技術(shù)快速區(qū)分酸羊奶的發(fā)酵菌種。通過電子鼻采集不同酸羊奶揮發(fā)成分的響應(yīng)值，然后利用主成分分析（principal component analysis，PCA）、Fisher線性判別分析（fisher linear discriminant analysis，F(xiàn)LDA）以及BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（back propagation neural network，BP-NN）分析進行判別，建立基于電子鼻技術(shù)區(qū)分酸羊奶發(fā)酵菌種的方法。結(jié)果表明，F(xiàn)LDA及PCA都能夠區(qū)分出不同菌種發(fā)酵的酸羊奶，F(xiàn)LDA區(qū)分效果優(yōu)于PCA。利用FLDA和BP-NN分析預(yù)測酸羊奶發(fā)酵菌種類別的正確率分別為100.0%和98.4%。因此，利用電子鼻快速區(qū)分酸羊奶的發(fā)酵菌種是可行的。

電子鼻；酸羊奶；乳酸菌；多元分析

酸奶是原料奶經(jīng)乳酸菌發(fā)酵制成的一類酸性奶制品[1]。酸奶發(fā)酵菌主要是嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌等以乙醛為主要風(fēng)味物質(zhì)的醛香型乳酸菌[2]。隨著對乳酸菌特性與功能研究的深入，新型益生菌（如雙歧桿菌、鼠李糖桿菌等）以及產(chǎn)丁二酮的風(fēng)味乳酸菌被廣泛應(yīng)用為發(fā)酵菌，更加滿足了消費者對營養(yǎng)價值和風(fēng)味的需求。目前，驗證酸奶中發(fā)酵菌種類的方法從最基礎(chǔ)的利用培養(yǎng)基和指示劑、生化試劑等方法發(fā)展到應(yīng)用不依賴純培養(yǎng)的分子生物學(xué)方法[3]。這些分析技術(shù)比較成熟，準確度較高，但同時也具有分離鑒定成本較高，操作復(fù)雜等缺點。

電子鼻技術(shù)是一種操作簡單、快速、準確的無損分析技術(shù)，它利用氣體傳感器陣列的響應(yīng)曲線識別樣品揮發(fā)成分的整體信息并應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)方法進行定性定量分析[4]。目前，電子鼻技術(shù)在乳品工業(yè)中的應(yīng)用主要集中在乳制品的產(chǎn)地鑒別[5]、貨架期及成熟期判定[6-11]、摻假分辨[12-13]以及有害微生物檢測[14]等方面，電子鼻在乳品工業(yè)中應(yīng)用的深度和廣度不斷擴大[15-16]。一些病原微生物作用于乳制品會產(chǎn)生某些風(fēng)味物質(zhì)，因此一些研究已表明電子鼻在檢測乳制品中有害微生物，如金黃色葡萄球菌、假單胞腐敗菌等的可行性[17-18]。本研究以6 種不同菌種發(fā)酵的酸羊奶為研究對象，用電子鼻檢測不同酸羊奶的揮發(fā)成分，進而利用Fisher線性判別分析（fisher linear discriminant analysis，F(xiàn)LDA）、BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（back propagation neural network，BP-NN）等分析實現(xiàn)酸羊奶發(fā)酵菌種的快速判別，為酸奶發(fā)酵菌種的快速區(qū)分提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蔗糖（食品級） 市售；羊奶 西北農(nóng)林科技大學(xué)西農(nóng)薩能奶山羊原種場畜牧基地；保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、雙歧桿菌、鼠李糖桿菌、丁二酮乳酸菌國家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心菌種保藏中心。

1.2 儀器與設(shè)備

PEN3電子鼻（含有10 個金屬氧化物傳感器陣列，各個傳感器的名稱及性能描述見表1） 德國Airsense公司；PHS-3C pH計 上海日島科學(xué)儀器有限公司；XHF-DY均質(zhì)機 寧波新芝生物科技有限公司；LMQ.J滅菌鍋 山東新華醫(yī)療器械有限公司；ZYJ-LT1無菌操作臺 西安富康空氣凈化設(shè)備工程有限公司。

表1 PEN3電子鼻傳感器名稱及性能描述Table 1 Description of the sensors and their performance used in the electronic nose (PEN3)

1.3 方法

1.3.1 酸羊奶樣品制備

將原羊奶過濾后添加質(zhì)量分數(shù)8%蔗糖，混勻均質(zhì)，巴氏殺菌（65 ℃、30 min）。冷卻至發(fā)酵溫度后分別接種體積分數(shù)2%活化好的嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌-保加利亞乳桿菌混合發(fā)酵菌（1∶1，V/V）、鼠李糖桿菌、雙歧桿菌、丁二酮乳酸菌共6 種發(fā)酵菌。接種后的奶樣在適宜溫度（表2）培養(yǎng)至pH 4.60，冷卻奶樣，于4 ℃貯藏24 h。

表2 每組奶樣發(fā)酵溫度Table 2 Fermentation temperature for each goat yogurt sample

1.3.2 電子鼻檢測

將制備好的奶樣取10 mL移入50 mL潔凈玻璃瓶中，每組奶樣分裝40 瓶，密封置于4 ℃冰箱并盡快分析。電子鼻檢測時，將每個密封樣品依次置于25 ℃環(huán)境平衡30 min后頂空進樣測量。

電子鼻實驗參數(shù)設(shè)置：樣品準備時間5 s；檢測時間60 s；測量計數(shù)1 s；自動調(diào)零時間10 s；清洗時間240 s；內(nèi)部流量400 mL/min；進樣流量400 mL/min。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用基于最小協(xié)方差（minimum covariance determinant，MCD）估計的穩(wěn)健馬氏距離異常值檢測方法[19]剔除異常值后，分別對數(shù)據(jù)進行主成分分析（principal component analysis，PCA）、FLDA及BP-NN分析。PCA、FLDA及BP-NN分析采用SPSS20處理；異常值檢測，訓(xùn)練集及驗證集劃分采用Matlab R2010a處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品傳感器信號分析

圖1 電子鼻對原奶樣揮發(fā)成分的響應(yīng)圖Fig.1 Response graph of sensors to volatile compositions of raw goat’s milk

對7 組羊奶的樣品進行電子鼻檢測，最終獲得電子鼻對各樣品的響應(yīng)圖。以原奶樣品為例（圖1），圖中每條曲線代表一個傳感器對該樣品揮發(fā)成分的響應(yīng)強度隨時間變化而變化的情況，響應(yīng)強度的高低也反映了傳感器對所測揮發(fā)成分的靈敏度大小。進樣后，電子鼻10 個傳感器的響應(yīng)值逐漸增大，然后趨于平穩(wěn)并在55 s后達到穩(wěn)定狀態(tài)，因此實驗選取55～59 s內(nèi)的平均響應(yīng)值作為特征值分析。另外，不同傳感器對奶樣的響應(yīng)不同，對照發(fā)現(xiàn)S1、S6、S7、S8 號傳感器對奶樣的響應(yīng)較大。這幾個傳感器分別對甲烷、乙醇、芳香物、硫化物等敏感，而奶類主要風(fēng)味物質(zhì)是乙醛、雙乙酰、揮發(fā)性脂肪酸、含硫有機物等，因此電子鼻能較好反映奶樣的整體信息。

為了直觀比較電子鼻對7 組奶樣響應(yīng)值的差異，將每組奶樣的平均特征值用雷達圖表示（圖2）。由圖2可以看出，不同組奶樣的響應(yīng)結(jié)果存在差異且S6、S7、S8、S9號傳感器的響應(yīng)值差異較大，所以可以根據(jù)電子鼻對不同組奶樣的響應(yīng)差異區(qū)分它們。

圖2 電子鼻對不同組奶樣響應(yīng)的雷達圖Fig.2 Radar plots of the responses on the sensors for different types of goat’s milks

2.2 異常值檢測

實驗共得到280 組數(shù)據(jù)，異常值會對結(jié)果產(chǎn)生很大的影響，甚至?xí)霈F(xiàn)錯誤的分析結(jié)果，因此異常值的診斷和處理非常必要。基于MCD估計的穩(wěn)健馬氏距離異常值檢測方法采用迭代方式構(gòu)造了一個穩(wěn)健的協(xié)方差矩陣和穩(wěn)健的均值向量，由此消除了多個異常值的掩蓋作用[19]，使得異常值能夠被正確識別。對原奶組應(yīng)用該方法檢測異常值，如圖3所示，1、2、29、31、33、38、39、40號共8 個樣品異常值被檢出，將這些異常值剔除。用同樣方法分別對7 組奶樣數(shù)據(jù)做MCD估計，剔除異常值后共得到224 組數(shù)據(jù)用于進一步分析。

圖3 原奶組MCD估計檢測異常值Fig.3 Outlier diagnosis plots obtained by MCD method for raw goat’s milk samples

2.3 PCA

PCA是一種無監(jiān)督分類方法，它是利用降維的思想，在損失較少信息的前提下把原來多個變量線性轉(zhuǎn)化為幾個新變量（主成分），選取較少數(shù)量的新變量就可以解釋原有變量的大部分變異[20]。將前2 個或3 個主成分得分值做圖，就得到主成分二維或三維散點圖。PCA主要用于客觀分析樣品之間的差異。

在PCA二維圖中（圖4），PC1的方差貢獻率為67.46%，PC2的方差貢獻率為17.58%，合計為85.04%。原奶組和各類酸奶組區(qū)分明顯；雙歧桿菌組和丁二酮乳酸菌組、嗜熱鏈球菌組和混合菌種組部分重疊；保加利亞乳桿菌組和鼠李糖桿菌組幾乎完全重疊。在PCA三維圖中（圖5），PC1、PC2、PC3的方差貢獻率合計為94.53%。嗜熱鏈球菌組和混合菌種組部分重疊，其余組區(qū)分明顯。PCA三維圖和二維圖比較，區(qū)分效果明顯改善，這主要是由于3 個主成分反映了不同類別奶樣的更多信息。另外，嗜熱鏈球菌組和混合菌種組部分重疊可能是由于這2 組奶樣的揮發(fā)性成分比較接近導(dǎo)致電子鼻對這些奶樣響應(yīng)值的真實差異較小，也可能是由于PCA前3 個主成分未能全部概括奶樣的整體差異引起的。

圖4 各類奶樣主成分析二維分圖Fig.4 PCA plot of goat’s milk samples with PC1 and PC2

圖5 各類奶樣主成分分析三維圖Fig.5 PCA plot of goat’s milk samples with PC1, PC2 and PC3

2.4 FLDA

圖6 各類奶樣線性分析二維圖Fig.6 LDA plot of goat’s milk samples with LD1 and LD2

FLDA是一種監(jiān)督分類方法，側(cè)重對樣品在空間中的分布狀態(tài)以及彼此之間的距離分析，將高維模式樣本投影到最佳鑒別矢量空間，以達到抽取分類信息和壓縮特征空間維數(shù)的效果，投影后保證模式樣本在新的子空間有最大的類間距離和最小的類內(nèi)距離，使得各類樣品能夠更好的區(qū)分，然后再根據(jù)樣本到每個類中心點的距離遠近判定將其歸于哪一個類別[21-22]。

圖7 各類奶樣線性分析三維圖Fig.7 LDA plot of goat’s milk samples with LD1, LD2 and LD3

在FLDA二維圖中（圖6），LD1方差貢獻率為59.47%，LD2方差貢獻率為33.04%，合計為92.51%。雙歧桿菌組和丁二酮乳酸菌組、嗜熱鏈球菌組和混合菌種組部分重疊，其余各組區(qū)分明顯。在FLDA三維圖中（圖7），LD1、LD2、LD3的方差貢獻率合計為96.18%。除嗜熱鏈球菌組和混合菌種組部分重疊外，其余各組區(qū)分明顯。

2.5 FLDA預(yù)測模型建立

2.5.1 訓(xùn)練集與驗證集的劃分

挑選具有代表性的樣本建立模型，即訓(xùn)練集樣本的代表性問題，是模型建立的核心問題。訓(xùn)練集樣本選取方法可以大致分為兩類：常規(guī)選擇和計算機識別。常規(guī)選擇在樣本量較大時，費時費力，而且選出的樣本集代表性不好，模型預(yù)測能力差。

DUPLEX方法是一種計算機識別方法[23]，實現(xiàn)過程如下：第一步，選取兩個彼此距離最遠的樣本點加入訓(xùn)練集中；第二步，從剩余的樣本點中，選取2 個彼此距離最遠的樣本點加入驗證集中。重復(fù)上述步驟，直至達到驗證集所需的樣本數(shù)，余下樣本則全部歸入訓(xùn)練集[24]。該方法的優(yōu)點是能保證訓(xùn)練集中樣本按照空間距離分布均勻。

使用該方法最終得到訓(xùn)練集（含160 個樣品）和驗證集（含64 個樣品），具體見表3。

表3 分組結(jié)果Table 3 Groupings of goat’s milk samples

2.5.2 模型建立與檢驗

在SPSS軟件中，將訓(xùn)練集作為FLDA的變量輸入，數(shù)字1、2、3、4、5、6、7分別代表原奶、嗜熱鏈球菌奶樣、保加利亞乳桿菌奶樣、混合菌種奶樣、鼠李糖桿菌奶樣、雙歧桿菌奶樣、丁二酮乳酸菌奶樣，并作為判別輸出。提取得到6 個維度的判別函數(shù)，具體如下：

上述6 個判別函數(shù)式計算的是建模樣本在各個維度上的坐標值。用這6 個函數(shù)式計算出各樣本的空間位置，然后計算各樣品到每組奶樣中心的距離，進而根據(jù)距離遠近判別其所屬類別。訓(xùn)練集中對不同奶樣的回判正確率及交叉驗證正確率為100.0%，驗證集的預(yù)測正確率也達到100.0%，表明該模型的適用性好，見表4。

表4 酸羊奶發(fā)酵菌種的FLDATable 4 Discrimination of goat s milk samples by FLDA

2.6 BP-NN分析

BP-NN是一種按誤差逆?zhèn)鞑ニ惴ㄓ?xùn)練的多層前饋型網(wǎng)絡(luò)，輸入信號由輸入層輸入并傳遞給隱含層，隱含層信息經(jīng)函數(shù)變換處理后，傳遞給輸出層，并將此輸出與期望輸出進行計算得出誤差，若誤差在不可接受范圍內(nèi)，則將誤差反向傳播給神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，重新計算各層的閾值和權(quán)值，直至得到可接受的結(jié)果才會結(jié)束訓(xùn)練。BP-NN的建模能力和非線性映射能力強，尤其適用于復(fù)雜模型的建立[25-26]。

利用2.5.1節(jié)得到的訓(xùn)練集構(gòu)建3 層BP-NN模型。輸入層結(jié)點數(shù)為10（10 個傳感器的響應(yīng)值），隱藏層結(jié)點數(shù)為9，輸出層結(jié)點數(shù)為7（7 類奶樣）；隱藏層和輸出層

的激活函數(shù)分別為雙曲正切和恒等函數(shù)，學(xué)習(xí)算法為共軛梯度下降法，學(xué)習(xí)率為0.001。

訓(xùn)練集中對不同奶樣的回判正確率為100%，驗證集的判斷正確率為98.4%，將一個鼠李糖桿菌發(fā)酵奶樣誤判為保加利亞乳桿菌發(fā)酵奶樣，見表5。

表5 酸羊奶發(fā)酵菌種的BP-NN判別Table 5 Discrimination of goat’ s milk samples by BP neural network

3 討 論

3.1 異常值的檢測及訓(xùn)練集的選取是影響模型性能的重要因素，采用MCD估計法消除了掩蓋作用，進而正確識別并剔除了異常值；采用DUPLEX方法劃分的訓(xùn)練集樣本更具有代表性，因此提高了模型的泛化能力。

3.2 PCA和FLDA都能夠大致區(qū)分原奶及不同菌種發(fā)酵酸羊奶，使用前3 個成分（三維圖）概括了原樣本更多的信息，所以區(qū)分效果比使用前2 個成分（二維圖）要好。FLDA區(qū)分的效果好于PCA區(qū)分的效果，這是因為FLDA主要突出樣本的判別（差異）特征，而PCA主要顯示樣本的描述特征。

3.3 分別建立FLDA和BP-NN判別酸羊奶發(fā)酵菌種模型。2種模型的預(yù)測正確率分別達100.0%和98.4%，從而驗證電子鼻技術(shù)應(yīng)用于酸奶發(fā)酵菌種快速區(qū)分的可行性。

3.4 建立判別模型時采用的樣本比較單一，因此，模型應(yīng)用于實際時還需要進行深入的研究。實際應(yīng)用時建模的樣本量應(yīng)該遠遠大于本實驗中的樣本量，同時應(yīng)注意對不同條件樣本的選取或根據(jù)不同條件（如不同產(chǎn)地、不同廠商等）分別建立相應(yīng)的判別模型，以降低模型的復(fù)雜度和預(yù)測風(fēng)險。

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Discrimination of Lactic Acid Bacteria in Goat Yogurt Using Electronic Nose

YANG Chun-jie, DING Wu*, MA Li-jie
(College of Food Science and Engineering, Northwest A & F University, Yangling 712100, China)

This study attempted to use an electronic nose (PEN3) to discrimina te the strains of lactic acid bacteria in goat yogurt samples. The volatile components emanating from goat yogurt samples were gathered by the electronic nose. Based on the data obtained, a method for discriminating the strains of l actic acid bacteria in goat yogurt was established through principal component analysis (P CA), Fisher linear discriminant analysis (FLDA) and BP neural network. The results showed that although both PCA and FLDA could discriminate differ ent species of lactic acid bacteria, FLDA was more effective than PCA. The correct prediction rates of FLDA and BP neural network were 100.0% and 98.4%, respectively. These res ults will be helpful for the application of electronic nose to discriminate the strains of lactic acid bacteria in goat yogurt samples.

electronic nose; goat yogurt; lactic acid bacteria; multivariate analysis

TS252.7

B

1002-6630（2014）18-0267-05

10.7506/spkx1002-6630-201418051

2013-11-27

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（3-45）

楊春杰（1985—），男，碩士研究生，研究方向為畜產(chǎn)品加工和食品安全。E-mail：18710423044@163.com

*通信作者：丁武（1971—），男，教授，博士，研究方向為畜產(chǎn)品加工和食品安全。E-mail：dingwu10142000@hotmail.com