對(duì)羥基苯甲酸酯類對(duì)杏果采后病害的控制

潘靜宇，李永才*，畢 陽(yáng)，唐 瑛，王 迪

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

對(duì)羥基苯甲酸酯類對(duì)杏果采后病害的控制

潘靜宇，李永才*，畢 陽(yáng)，唐 瑛，王 迪

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

通過(guò)離體和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究對(duì)羥基苯甲酸酯類處理對(duì)杏果采后黑斑病和軟腐病的控制。離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)羥基苯甲酸酯類對(duì)互隔交鏈孢（Alternaria alternata）和匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）菌絲生長(zhǎng)具有一定的抑制作用，其中對(duì)羥基苯甲酸乙酯和對(duì)羥基苯甲酸丁酯抑制效果較好，并隨著處理劑量的增加抑制效果顯著增加，100 μL/ L對(duì)羥基苯甲酸丁酯對(duì)A. alternata和R. stolonifer菌落生長(zhǎng)的抑制效果佳，其對(duì)菌落直徑的抑菌率分別達(dá)到了23.70% 和62.48%，同時(shí)發(fā)現(xiàn)對(duì)羥基苯甲酸酯類對(duì)R. stolonifer的抑制作用較強(qiáng)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)羥基苯甲酸酯類能有效地控制損傷接種的杏果黑斑病和軟腐病的擴(kuò)展，對(duì)軟腐病的控制效果較好。其中240 μL/ L的對(duì)羥基苯甲酸乙酯對(duì)杏果黑斑病和軟腐病的抑制效果最佳。進(jìn)一步通過(guò)正交試驗(yàn)確定了對(duì)羥基苯甲酸酯 類與熱水復(fù)合對(duì)杏果的最佳防腐處理?xiàng)l件為32 μL/ L的對(duì)羥基苯甲酸丙酯，在50 ℃熱水中浸泡7 min，該復(fù)合對(duì)采后杏果的病害控制效果最佳，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，其對(duì)黑斑病和軟腐病的抑菌率分別達(dá)到了32.22%和51.84%。

對(duì)羥基苯甲酸酯類；杏果；互隔交鏈孢；匍枝根霉；病害控制

杏（A rmeniaca vulgaris）屬薔薇科（Rosaceae）喬木。蘭州大接杏是甘肅地方優(yōu)良品種，該品種適應(yīng)性強(qiáng)，風(fēng)味濃甜，屬中熟鮮食品種，年產(chǎn)量約5～6萬(wàn) t。杏具有良好的加工性能[1]，其果味道鮮美、酸甜可口，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高。但杏果皮薄，易受機(jī)械損傷，且杏果屬于呼吸躍變型果實(shí)，常溫條件下貯藏時(shí)間很短，貯藏后期腐爛嚴(yán)重，其采后病害主要有黑斑病、軟腐病、菌核病、褐腐病等[2]。其中以匍枝根霉（R. stolonifer）引起的軟腐病和互隔交鏈孢（A. alternata）引起的黑斑病尤為嚴(yán)重，造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失，目前多用人工合成殺菌劑控制病害，這不但會(huì)產(chǎn)生農(nóng)藥殘留、污染環(huán)境，而且會(huì)使病原物產(chǎn)生抗病性，因此尋求安全、低毒、高效的杏果采后病害防腐劑已勢(shì)在必行。

對(duì)羥基苯甲酸酯亦稱尼泊金酯，具有高效、低毒、廣譜、易配伍的優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛運(yùn)用于食品、飲料、化妝品、醫(yī)藥等許多方面[3]，我國(guó)2002年正式批準(zhǔn)對(duì)羥基苯甲酸乙酯、丙酯為食品添加劑[4]。對(duì)羥基苯甲酸酯類除對(duì)真菌有效外，由于其具有酚羥基結(jié)構(gòu)，所以抗細(xì)菌性能比苯甲酸、山梨酸都強(qiáng)。目前，果蔬采后疾病的控制方法主要包括生物防治、物理方法如加熱和輻射等，化學(xué)方法如添加毒性低、使用安全的食品添加劑等[5-6]，例如通過(guò)使用合成殺菌劑如抑霉唑、噻苯咪唑等[7]，但這種方法會(huì)帶來(lái)潛在的健康危害和環(huán)境污染等問(wèn)題。有研究表明對(duì)羥基苯甲酸鈉鹽在草莓、柑橘等果蔬采后病害控制中表現(xiàn)出顯著地作用[8-9]，Moscoso-Ramirez等[10]發(fā)現(xiàn)對(duì)羥基苯甲酸鈉鹽能有效的控制采后柑橘的青霉病和綠霉病，通過(guò)改變處理?xiàng)l件，諸如濕度、溫度、處理時(shí)間、復(fù)合處理等，發(fā)現(xiàn)相對(duì)一般殺菌劑有更好的防腐效果[11]。但目前對(duì)羥基苯甲酸酯在杏果采后病害控制中未見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以杏果為試材，通過(guò)體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究對(duì)羥基苯甲酸酯類對(duì)杏果采后主要致腐菌A. alternata和R. stolonifer的抑制作用和對(duì)黑斑病及軟腐病的控制效果，并通過(guò)正交試驗(yàn)確定了其最佳的防腐處理?xiàng)l件，以期為杏果采后病害控制提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試杏果：蘭州大接杏2013年7月購(gòu)于蘭州市安寧區(qū)桃海市場(chǎng)，剔除病果傷果，選擇大小、果色均勻且成熟度一致的果實(shí)，分組并立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；供試菌株為Rhizopus stolonifer和Alternaria alternata。

對(duì)羥基苯甲酸酯類（甲酯、乙酯、丙酯、丁酯）上海中秦化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；DHP-9272B型恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；CX21FS1C生物顯微鏡 奧林巴斯（廣州）工業(yè)有限公司；VXH-3微型漩渦混合器 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基制作

參照方中達(dá)[12]方法進(jìn)行。培養(yǎng)基（PDA）配方為：馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂17～20 g、蒸餾水1 000 mL。將200 g馬鈴薯削皮后切成1 cm3體積的小塊，加水煮沸30 min后4 層紗布過(guò)濾并定容至1 000 mL，然后將一定量瓊脂和蔗糖分別與馬鈴薯過(guò)濾液混合，分裝在三角瓶中進(jìn)行高壓滅菌，制備PDA平板。

1.3.2 病原菌分離、純化與鑒定

參照李永才[13]的方法進(jìn)行。采集軟腐病和黑斑病病果，用75%酒精表面消毒，再用無(wú)菌水沖洗后切取病健交界組織，在無(wú)菌操作條件下移至PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃保溫培養(yǎng)，待長(zhǎng)出分生孢子之后進(jìn)行分離、純化，分離純化后的菌種要經(jīng)過(guò)侵染回接實(shí)驗(yàn)才能認(rèn)定其致病性。將各分離純化后的菌株回接到杏果上，如果發(fā)病癥狀與貯藏時(shí)出現(xiàn)的病癥相符合，方可作為采后病害病原菌進(jìn)一步鑒定到屬種，鑒定后在PDA培養(yǎng)基上保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 離體抑菌實(shí)驗(yàn)

參照范青等[14]的方法進(jìn)行并作修改。分別取15 mL含有20、40、60、80、100 μL 5%對(duì)羥基苯甲酸甲酯醇溶液、對(duì)羥基苯甲酸乙酯醇溶液、對(duì)羥基苯甲酸丙酯醇溶液、對(duì)羥基苯甲酸丁酯醇溶液的PDA培養(yǎng)基（以每1 L計(jì)），將其均勻平鋪在直徑為8 cm的培養(yǎng)皿中，以不加藥物的PDA為對(duì)照，待平板冷卻后分別將純化的R. stolonifer菌餅和A. alternata菌餅（直徑8 mm）接于培養(yǎng)皿中央，28 ℃條件下避光培養(yǎng)。當(dāng)對(duì)照培養(yǎng)皿中的菌斑長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿時(shí)，測(cè)定各處理菌落直徑，上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。并參照吳慧昊等[15]方法計(jì)算其抑菌率。

1.3.4 孢子懸浮液的配制

參照劉紅霞等[16]的方法并修改，在進(jìn)行分離、純化、鑒定后培養(yǎng)7 d的A. alternata和R. stolonifer中各倒入少量無(wú)菌水，加入少量0.01% Tween-80，用滅過(guò)菌的涂布棒輕刮，并通過(guò)4 層紗布過(guò)濾到三角瓶中，用無(wú)菌水稀釋，在混合器上振蕩15 s，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將其配制成105CFU/mL孢子懸浮液。

1.3.5 對(duì)羥基苯甲酸酯類對(duì)損傷接種杏果病害擴(kuò)展的控制

參照Moscoso-Ramirez等[10,17]的方法，在初步劑量篩選的基礎(chǔ)上，選擇大小、果色均勻一致、無(wú)傷病的果實(shí)用2%次氯酸鈉溶液浸泡2 min，清水沖洗，晾干，用70%酒精進(jìn)行消毒，然后用滅菌鐵釘（直徑3 mm）在果實(shí)赤道部位均勻刺3 mm×3 mm孔2 個(gè)，每孔中注入兩種上述孢子懸浮液10 μL，接種2 h后在刺孔中各接入等量劑量為0、48、96、144、192、240 μL/L已配制好的對(duì)羥基苯甲酸酯類溶液。晾干后用保鮮袋包裝在25～35 ℃條件下貯藏，7 d后用十字交叉法測(cè)定病斑直徑，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參照李永才等[18]的方法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇合適的對(duì)羥基苯甲酸酯類、適當(dāng)?shù)乃幤穭┝浚谠O(shè)定好的熱水溫度中浸泡一定的時(shí)間，選用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表1），在杏果上進(jìn)行試驗(yàn)，參照1.3.5節(jié)方法進(jìn)行處理及結(jié)果分析。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)表Table 1 Factors and levels for orthogonal aray design

1.4 數(shù)據(jù)處理

病斑直徑的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2003軟件進(jìn)行處理，并用SPSS 19.0進(jìn)行最小顯著差數(shù)法比較差異顯著性（P=0.05）及正交試驗(yàn)結(jié)果，用Duncans’多重差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)羥基苯甲酸酯類對(duì)A. alternata和R. stolonifer菌落生長(zhǎng)的影響

表2 對(duì)羥基苯甲酸酯類對(duì)A. alternata R. stolonifer菌落生長(zhǎng)（直徑）的影響Table 2 Effect of -hydroxybenzoic acid esters on mycelium growth of A. alternata and R. stolonifer mm

由表2可知，對(duì)羥基苯甲酸酯類處理可有效地抑制A. alternata和R. stolonifer菌落生長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)各處理后菌落直徑均低于對(duì)照值。不同藥品的抑制效果均隨著處理劑量的提高而提高。不同藥品的抑菌效果也有所差異，相比而言，對(duì)羥基苯甲酸乙酯和對(duì)羥基苯甲酸丁酯對(duì)病原物的抑制效果較好，而對(duì)羥基苯甲酸甲酯的抑制效果最差，尤其在較低劑量時(shí)（≤40 μL/L）對(duì)A. alternata的抑制效果與對(duì)照差異不顯著。其中100 μL/L的對(duì)羥基苯甲酸丁酯處理后抑菌效果較佳，對(duì)A. alternata和R. stolonifer菌落直徑生長(zhǎng)的抑菌率分別為23.70%和62.48%，菌落均值較對(duì)照組分別降低了36.84%和59.60%，由此可知對(duì)羥基苯甲酸丁酯對(duì)R. stolonifer的抑制效果明顯優(yōu)于A. alternata，并且達(dá)到了顯著的抑菌效果（P＜0.05）。

2.2 對(duì)羥基苯甲酸酯類處理對(duì)損傷接種的杏果黑斑病和軟腐病的控制

對(duì)羥基苯甲酸酯類處理可顯著抑制損傷接種的杏果實(shí)黑斑病和軟腐病的病斑擴(kuò)展（表3）。不同種類的藥品對(duì)損傷接種杏果黑斑病和軟腐病的擴(kuò)展的抑制作用存在差異，比較所得病斑均值，總體上發(fā)現(xiàn)對(duì)羥基苯甲酸丁酯和對(duì)羥基苯甲酸乙酯的控制效果較好，其處理后病斑直徑較對(duì)照組分別降低了46.63%和43.24%。而對(duì)羥基苯甲酸甲酯的抑制效果較差。同時(shí)杏果實(shí)病斑擴(kuò)展程度均隨著不同藥品劑量的增大而減小。240 μL/L的對(duì)羥基苯甲酸丁酯對(duì)黑斑病和軟腐病病斑的抑制效果最佳，其病斑直徑較對(duì)照組分別降低了45.48%和68.76%，與對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05）。但對(duì)羥基苯甲酸酯類處理對(duì)黑斑病和軟腐病擴(kuò)展的控制效果差異不顯著。

表3 對(duì)羥基苯甲酸酯類對(duì)杏果黑斑病和軟腐病的控制效果Table 3 Effect of -hydroxybenzoic acid ester on black spot and soft rot diseases of apricot fruitsmm

2.3 對(duì)羥基苯甲酸酯類與熱水復(fù)合處理控制杏果采后病害的條件正交試驗(yàn)優(yōu)化

表4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Orthogonal array design and results

由表4可見(jiàn)，因素的主次關(guān)系為A＞C＞B＞D，即影響病害程度的主次因素為：藥品劑量＞熱浸泡時(shí)間＞藥品種類＞熱處理溫度；最優(yōu)配方為A2C2B2D3，即選用32 μL/L的對(duì)羥基苯甲酸丙酯，在50 ℃的熱溶液中浸泡7 min，此時(shí)對(duì)采后杏果的病害控制效果最佳。進(jìn)行差異性檢驗(yàn)可知，藥品劑量對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響顯著（P＜0.05），其他因素的影響不顯著。

因表中處理2與最優(yōu)水平不一致，進(jìn)一步通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)對(duì)優(yōu)水平進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果表明最優(yōu)水平對(duì)黑斑病和軟

腐病的抑菌率分別達(dá)到了32.22%和51.84%，較處理2的抑制效果更顯著，表明復(fù)合處理的抑菌效果顯著優(yōu)于對(duì)照組及單獨(dú)處理（圖1）。

圖1 最優(yōu)條件下復(fù)合處理對(duì)杏果病斑直徑的影響Fig.1 Effect of combinatorial treatment under optimal conditions on lesion diameter in apricot fruits

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)羥基苯甲酸酯類處理對(duì)A. alternata和R. stolonifer菌絲生長(zhǎng)具有顯著的抑制效果，總的來(lái)看存在碳鏈越長(zhǎng)、處理劑量越高，對(duì)病原物生長(zhǎng)的抑制作用越強(qiáng)的趨勢(shì)，100 μL/L劑量的各酯類對(duì)A. alternata和R. stolonifer菌落生長(zhǎng)均表現(xiàn)出良好的抑制作用，這與前人研究發(fā)現(xiàn)對(duì)羥基苯甲酸酯鈉能有效抑制B. cinerea[8]、P. expansum和P. digitatum[10,17]孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)的結(jié)果相一致。對(duì)羥基苯甲酸酯類的抑菌作用與苯酚類似，可破壞微生物的細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)變性，并抑制微生物細(xì)胞的呼吸酶系與電子傳遞酶系的活性[19-20]。但其在水中溶解度差，其溶解度隨酯基碳鏈長(zhǎng)度的增加而下降（如甲酯為0.25 g/100 mL，庚酯僅1.5 mg/100 mL），抗菌效果則與分子中醇鏈長(zhǎng)度呈正比，毒性與醇鏈長(zhǎng)度呈反比。對(duì)羥基苯甲酸酯類常用的抑菌濃度為0.05%，為了更好地發(fā)揮防腐作用，一般都是將不同的酯類混合使用[21-22]，也可與苯甲酸等混合使用，取其協(xié)同作用。近些年來(lái)，又開(kāi)發(fā)了多種催化劑，使尼泊金酯的收率和品質(zhì)都大有提高[23]。

Moscoso-Ramirez等[10,17]發(fā)現(xiàn)采用25 μL/L的藥品劑量進(jìn)行浸泡處理，并控制處理溫度、濕度，采用復(fù)合處理實(shí)驗(yàn)不同時(shí)間后可觀察到其對(duì)病原物顯著的防腐作用，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)及正交試驗(yàn)，結(jié)果表明對(duì)羥基苯甲酸酯類對(duì)黑斑病和軟腐病具有良好的控制效果，同時(shí)發(fā)現(xiàn)提高藥物處理溫度可有效降低藥物的處理劑量。可見(jiàn)對(duì)羥基苯甲酸酯類在采后病害控制中具有潛在的應(yīng)用前景[24-25]。

世界上許多國(guó)家和地區(qū)允許對(duì)羥基苯甲酸酯鈉應(yīng)用于食品，對(duì)羥基苯甲酸酯類在食品領(lǐng)域中的使用歷史已超過(guò)50 a，美國(guó)藥品監(jiān)督局和歐盟早在30多年前就已批準(zhǔn)對(duì)羥基苯甲酸甲酯和對(duì)羥基苯甲酸乙酯可在食品中應(yīng)用，總體劑量在450～2 000 μL/L之間。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織下的食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)規(guī)定對(duì)羥基苯甲酸酯類的每日推薦攝入量為0～10 mg/（kg·d），我國(guó)于2002年3月批準(zhǔn)對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉、對(duì)羥基苯甲酸乙酯鈉和對(duì)羥基苯甲酸丙酯鈉作為食品防腐劑[26]，GB 2760—2007《食品添加劑食用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定對(duì)羥基苯甲酸酯類的最高使用劑量可達(dá)到0.5 g/kg。有研究表明對(duì)羥基苯甲酸酯通過(guò)腸道和皮膚迅速被吸收，經(jīng)體液循環(huán)被體內(nèi)酶水解后，代謝為水溶性較好的對(duì)羥基苯甲酸，最終隨尿液快速排出體外。但仍然有部分藥品會(huì)與其他物質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物而不能被人體完全吸收排出，可能會(huì)引起毒理學(xué)反應(yīng)等不良后果。雖然對(duì)羥基苯甲酸酯類等安全、低毒的化學(xué)防腐劑可用來(lái)代替或部分代替化學(xué)藥物控制果蔬的采后病害[27]，改善人類面臨的藥物的安全性與生態(tài)平衡兩大難題具有重要應(yīng)用前景，但是對(duì)其作用機(jī)理及采后規(guī)范化的應(yīng)用技術(shù)尚需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

4.1 100 μL/L的對(duì)羥基苯甲酸酯類處理對(duì)A. alternata和R. stolonifer菌落生長(zhǎng)均表現(xiàn)出良好的抑制作用，其中乙酯和丁酯的抑菌效果相對(duì)較好，抑菌率均值分別為34.07%和84.43%。

4.2 對(duì)羥基苯甲酸酯類的劑量為240 μL/L時(shí)，對(duì)杏子黑斑病和軟腐病病斑擴(kuò)展抑制效果最佳，其中對(duì)羥基苯甲酸丁酯的處理效果最為明顯。

4.3 由正交結(jié)果可知，影響病害程度的主次因素為：藥品劑量＞熱處理時(shí)間＞藥品種類＞熱處理溫度；最優(yōu)配方為A2C2B2D3，即選用32 μL/L的對(duì)羥基苯甲酸丙酯，在50 ℃條件下熱處理7 min。藥品劑量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響顯著（P＜0.05），其他因素的影響不顯著。通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到一致的結(jié)果，表明復(fù)合處理的防控效果顯著優(yōu)于對(duì)照組及單獨(dú)處理。

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Effect of p-Hydroxybenzoic Acid Esters on Controlling Postharvest Diseases of Apricot Fruits

PAN Jing-yu, LI Yong-cai*, BI Yang, TANG Ying, WANG Di
(College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

Effect of p-hydroxybenzoic acid esters on black spot and soft rot diseases of postharvest apricot fruits was studied using in vitro and in vivo tests. The results of in vitro test showed that p-hydroxybenzoic acid esters significantly inhibited the colony growth of Rhizopus stolonifer and Alternaria alternata. Ethyl 4-hydroxy benzoate and butyl paraben had better effect in a concentration-dependent manner. Butyl paraben, when use at a dose of 100 μL/L, was more effective against the two pathogens with antifungal rate s of 23.70% and 62.48%, respecti vely. The inhibitory effect of p-hydroxybenzoic acid esters on Rhizopus stolonifer was better. In vivo test showed that p-hydroxybenzoic acid esters could effectively control black spot and soft rot diseases of apricot fr uits inoculated with R. stolonifer and A. alternata. p-Hydroxyl benzoate was more effective against soft rot disease, and the development of black spot disease was significantly reduced by ethyl 4-hydroxybenzoate treatment at a dose of 240 μL/L. The optimum treatment conditions for postharvest disease control of apricot fruits were determined through orthogonal array design as 32 μL/L propyl p-hydroxyl benzoate comb ined with soaking in 50 ℃ water for 7 min. Verification results showed that the inhibition rates of the optimal treatment against black spot and soft rot disease reached 32.22% and 51.84%, respectively.

p-hydroxyl benzoate; apricot fruit; Alternaria alternata; Rhizopus stolonifer; disease control

TS201.3

A

1002-6630（2014）18-0262-05

10.7506/spkx1002-6630-201418050

2014-01-19

潘靜宇（1992—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樯谰鷮?duì)采后果蔬的抗病機(jī)理。E-mail：13993109268@163.com

*通信作者：李永才（1972—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)楣卟珊笊飳W(xué)與技術(shù)。E-mail：liyongcai@gsau.edu.cn