藏族非綜合征性耳聾兒童患者GJB2 SLC26A4 MTRNR1基因突變分析＊

巴 羅，邊 片，尼瑪吉宗，楊風林，張桂林

（西藏自治區人民醫院耳鼻咽喉科，西藏 拉薩850000）

新生兒重度聽力障礙發病率為1／1000，其中半數與遺傳因素相關［1］。遺傳性耳聾具有高度的遺傳異質性，到目前為止，己定位的非綜合征型耳聾致病基因位點有100余個，已克隆的耳聾相關基因70余個（Guy Van Camp，Richard Smith；The Hereditary Hearing loss Homepage；last update：January 7th，2014；http：／／hereditaryhearingloss．org／main．aspx－c＝HHH＆n＝86162）。國內外已有多項大規模研究證實GJB2、SLC26A4、MTRNR1（12SrRNA）三個基因是最主要的致聾基因，在中國漢族非綜合征型耳聾患者中，19．1%的患者攜帶GJB2復合雜合突變；其次是SLC26A4，12．1%的患者攜帶復合雜合；線粒體的 MTRNR1基因A1555G 突變攜帶率是1．6%［2～4］。本研究重點分析西藏自治區藏族先天性耳聾患者中，重度－極重度耳聾患者的GJB2、SLC26A4、MTRNR1（12SrRNA）基因突變發生的幾率、突變形式和突變熱點，為西藏自治區耳聾患者的早期診斷和早期干預提供有價值的數據。

1 對象和方法

1．1 對象選擇 選取2012年1月～2014年1月西藏自治區各大醫院出生的新生兒中臨床確診的耳聾患者13例，以及經西藏自治區殘聯確診的14例，共27例藏族耳聾患者納入本研究。27例患者均為先天性、非綜合征性、重度－極重度耳聾患者。另選取種族匹配的正常者101例作為對照。所有受試人員本人及患者家屬同意加入本研究并自愿簽署知情同意書。27例患者中男性9例，女性18例，年齡3～12歲，中位年齡5歲。所有患者都行CT和MRI檢查，未發現外、中、內耳形態異常；查體未發現糖尿病、視力障礙、神經系統、皮膚等其他系統病變；亦無感染、創傷、使用耳毒性藥物等其它環境致聾因素。

1．2 診斷標準 本研究的耳聾表型分析判斷標準參照Van Camp等2003年提出的《非綜合征型遺傳性耳聾家系遺傳學及聽力學描述術語建議案》：①根據是否伴有全身其他器官系統的異常而分為非綜合征型聾和綜合征型聾。②根據聽力損失的性質分為傳導性聾、感音神經性聾及混合性聾。③根據語言發育階段分為語前聾和語后聾。④根據聽力損失的頻率分為高頻聽力損失型（2～8kHz聽力下降為主）、低頻聽力損失型（0．25～0．5kHz聽力下降為主）、中頻聽力損失型（0．5～2kHz聽力下降為主）和全頻聽力損失型（0．25～8kHz聽力下降）。⑤聽力損失程度按照兩耳中聽力較好一耳的平均聽閾（0．5～4kHz聽閾的平均值）來評估：20～40dB HL為輕度聽力損失，41～70dB HL為中度聽力損失，71～95dB HL為重度聽力損失，＞95dB HL為極重度聽力損失（M．Mazzoli，G．Van Camp；The Hereditary Hearing loss Homepage；http：／／hereditaryhearingloss． org／main． aspx－c ＝HHH＆n＝86638）。

1．3 實驗方法

1．3．1 提取DNA 取外周血2～5ml，酚－氯仿法提取基因組DNA，溶解于TE溶液，分光光度計定量和純度檢測后，－70℃保存備用。

1．3．2 引 物 設 計 通 過 Primer3．0 軟 件 （http：／／bioinfo．ut．ee／primer3－0．4．0／）對GJB2、SLC26A4、MTRNR1（12SrRNA）三個基因全部編碼區設計引物，引物長度18～27bp，擴增片段長度250～1000 bp。測序擴增片段應包含所有全部編碼區，且測序引物序列應距編碼區40bp左右，引物序列見表1。

1．3．3 PCR擴增 反應體系為50μl，含10×PCR 緩沖液5μl，250μmoldNTPs（AmershamPharmcia），正反向引物各50ng，ExTag酶2U （TaKaRa），gDNA0．1μg。PCR反應在9600型PCR擴增儀（ABI）上完成，反應條件為：95℃預變性4min，95℃變性45s，60～55℃復性40s（根據不同引物調整），72℃延伸60s，30個循環，反應終止后再72℃延伸10min，4℃保存。

1．3．4 直接測序 使用ABI 3730XL型DNA測序儀，測序引物為擴增引物。

1．3．5 使用BLASTn程序在線將測序結果與含該基因的基因組序列相比較（http：／／blast．ncbi．nlm．nih．gov／Blast．cgi－PROGRAM＝blastn＆PAGE－TYPE＝BlastSearch＆LINK－LOC＝blasthome）。引物序列擴增片斷長度及退火溫度見表1。

表1 引物序列、擴增片斷長度及退火溫度Table 1 The detail information of primer

2 結果

本研究中，27例確診重度－極重度非綜合征型耳聾患者中21例為散發病例，6例家族中有其他成員罹患耳聾，全部為語前聾，且沒有氨基糖甙類藥物使用史。在所有27例患者中，未發現有GJB2、SLC26A4、MTRNR1（12SrRNA）三個基因編碼區攜帶任何致病突變。在101例種族匹配的正常對照者中，也未發現此三個基因的致病突變。本研究27例患者中，發現在GJB2基因中的2種常見多態性改變V27I（等位基因頻率為27．8%）和 E114G（等位基因頻率為16．7%），見圖1。在101例正常對照者中，也發現在GJB2基因中的2種常見多態性改變V27I（等位基因頻率為19．8%）和E114G（等位基因頻率為14．9%）。

圖1 本研究中發現的GJB2基因兩種多態性改變V27I和E114G的測序峰圖Figure 1 The peak figure of V27Iand E114GSNP in GJB2

3 討論

耳聾是交流障礙最常見的病因，全球至少有二億五千萬人罹患中度以上聽力損失，我國聽力言語殘疾人口已達到2000余萬，居各種殘疾之首，且每年新增聾兒3萬。耳聾的病因復雜，環境和遺傳因素都可致病。上世紀90年代以來，隨著耳聾分子病因學研究的深入，遺傳因素在耳聾發病中的地位得到重視，在許多國家已將遺傳性耳聾的基因診斷列入常規臨床檢測項目。耳聾基因具有高度異質性，即使在GJB2、SLC26A4、MTRNR1（12SrRNA）三個最主要致聾基因中，基因突變譜在各種族中有很大差異，以GJB2基因為例，每個種族中都有高發的致病突變，如35delG突變在高加索人中［5，6］；167delT突變在德系猶 太 人中［7］；235delC突 變 在 中 國、韓 國 和 日 本 人 中［8，9］；R143W突變在非洲人中［10］。這種等位基因的種族多樣性更可能是由先證者效應引起，而非是突變熱點［11］。

在最近的一項關于南方和北方典型漢族人群中的耳聾分子病因學研究顯示，GJB2基因突變導致的耳聾占18．31%，SLC26A4基因突變導致的耳聾占13．73%，MTRNR1（12SrRNA）基因突變導致的耳聾占1．76%［12］，其結果符合以往關于中國人中的耳聾分子病因學研究［3，4］。尚未發現在中國人口占主要多數的漢、蒙、滿、回、壯和苗族中，遺傳性耳聾的分子病因譜有明顯的差別。

但是在另一項針對西藏114例藏族耳聾病人參加的分子病因學研究中，只發現2人攜帶雜合性GJB2基因的致病突變，沒有病人同時攜帶兩個致病突變；也沒有發現SLC26A4基因明確的致病突變，且沒有病人同時攜帶兩個突變。這項研究第一次發現在大部分人群中最常見的GJB2和SLC26A4耳聾基因不是藏族耳聾病人的主要致病基因［13］。本研究中27例確診為重度－極重度非綜合征型耳聾患者中未發現有GJB2、SLC26A4 2個基因編碼區攜帶任何致病突變，進一步證實了上述研究的結果。而本研究沒有發現線粒體基因突變，可能由于本研究樣本量較少有關，因此不能否定線粒體基因突變在藏族耳聾患者中的致病作用。因此，可以確認藏族耳聾病人擁有不同于其他種族的分子病因學特點。隨著二代測序技術的發展和普及，進一步探索并發現導致藏族人群中非綜合征性耳聾的病因構成將是我們下一步的工作。

西藏地區由于長期受特殊地理環境、歷史以及文化等各種因素的影響，具有諸多特點：①西藏地處高原環境，平均海拔3500～4000m，常年氧分壓低，含氧量僅占平原的50%～60%左右，這種低氧環境對機體各臟器均有不同程度的影響。有研究表明，低氧條件對人體聽力影響最大。②農牧民人口眾多，社會經濟較落后，平均受教育程度較低等現狀，導致對新生兒聽力健康觀念差。③由于特殊的原因，鏈霉素及慶大霉素等耳毒性藥物在藏區仍廣泛使用，故藥物性耳聾也成為西藏地區耳聾的主要原因之一。④由于受當地風俗習慣的影響，仍存在著近親結婚的現象，致遺傳性耳聾發病率較高，且人口分散，存在大量隔離人群。⑤高原地區新生兒缺血缺氧性腦病高發病率和農牧民孕婦營養不良者居多，導致極低體重兒的高出生率等諸多因素，高危新生兒發生聽力障礙而產生疊加效應。

根據2006年第二次全國殘疾人抽樣調查結果，在西藏自治區聽力殘疾人占人口總數的1．65%，略高于全國平均水平（1．54%）。考慮到西藏地區，環境因素在耳聾的病因構成中占據重要位置，因此，藏族人群由于地域限制造成的隔離性，決定了在耳聾分子病因學上與其他種族可能存在較大差異。鑒于西藏自治區有著巨大的聾人群體，且耳聾病因學研究起步較晚，對于遺傳因素在耳聾病因構成中的地位研究還不多，因此，加快西藏地區的耳聾分子病因學研究，將進一步揭示藏族人群的耳聾病因學特點，并可促進本地區的聾病防治工作。

4 結論

GJB2、SLC26A4、MTRNR1基因是許多種族中最常見的耳聾基因，但每個種族中都有不同高發的致病突變，在各種族中有很大差異。國內耳聾分子病因學研究尚未發現在中國人口占主要多數的漢、蒙、滿、回、壯和苗族中，遺傳性耳聾的分子病因譜有明顯的差別。但我們的研究顯示，這三個基因并不是藏族耳聾病人的主要致病基因。這可能是由于藏族人群地域限制造成的隔離性，導致在耳聾分子病因學上，與其他種族可能存在較大的差異。

［1］ Morton NE．Genetic epidemiology of hearing impairment［J］．Ann N Y Acad Sci，1991，630（1）：16－31．

［2］ Dai P，Yu F，Han B，et al．GJB2mutation spectrum in 2063 Chinese patients with nonsyndromic hearing impairment［J］．J Transl Med，2009，7（1）：26－38．

［3］ Ji YB，Han DY，Lan L，et al．Molecular epidemiological analysis of mitochondrial DNA12SrRNA A1555G， GJB2，and SLC26A4mutations in sporadic outpatients with nonsyndromic sensorineural hearing loss in China［J］．Acta Otolaryngol，2011，131（2）：124－129．

［4］ Yuan Y，Guo W，Tang J，et al．Molecular epidemiology and functional assessment of novel allelic variants of SLC26A4in non－syndromic hearing loss patients with enlarged vestibular aqueduct in China［J］．PLoS One，2012，7（11）：e49984．

［5］ Zelante L，Gasparini P，Estivill X，et al．Connexin26mutations associated with the most common form of non－syndromic neurosensory autosomal recessive deafness（DFNB1）in Mediterraneans［J］．Hum Mol Genet，1997，6（9）：1605－1609．

［6］ Murgia A，Orzan E，Polli R，et al．Cx26deafness：mutation analysis and clinical variability［J］．J Med Genet，1999，36（11）：829－832．

［7］ Morell RJ，Kim HJ，Hood LJ，et al．Mutations in the connexin 26gene（GJB2）among Ashkenazi Jews with nonsyndromic recessive deafness［J］．N Engl J Med，1998，339（21）：1500－1505．

［8］ Abe S，Usami S，Shinkawa H，et al．Prevalent connexin 26 gene（GJB2）mutations in Japanese［J］．J Med Genet，2000，37（1）：41－43．

［9］ Liu XZ，Xia XJ，Ke XM，et al．The prevalence of connexin 26（GJB2）mutations in the Chinese population［J］．Hum Genet，2002，111（4－5）：394－397．

［10］ Brobby GW，Muller－Myhsok B，Horstmann RD．Connexin 26 R143Wmutation associated with recessive nonsyndromic sensorineural deafness in Africa［J］．N Engl J Med，1998，338（8）：548－550．

［11］ Van Laer L，Coucke P，Mueller RF，et al．A common founder for the 35delG GJB2gene mutation in connexin 26hearing impairment［J］．J Med Genet，2001，38（8）：515－518．

［12］ Yuan Y，You Y，Huang D，et al．Comprehensive molecular etiology analysis of nonsyndromic hearing impairment from typical areas in China［J］．J Transl Med，2009，7（1）：79－91．

［13］ Yuan Y，Zhang X，Huang S，et al．Common molecular etiologies are rare in nonsyndromic Tibetan Chinese patients with hearing impairment［J］．PLoS One，2012，7（2）：e30720．