雞西地區(qū)豬戊型肝炎病毒的檢測(cè)及序列分析

曲立春 黑龍江工業(yè)學(xué)院 158100

本文將探討雞西地區(qū)豬戊型肝炎病毒檢測(cè)結(jié)果及分析其序列特征，為確定本地區(qū)豬戊型肝炎病毒基因型提供可靠依據(jù)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

在雞西地區(qū)60 個(gè)豬場(chǎng)采集豬糞便樣本，每個(gè)豬場(chǎng)采集10 頭豬，共600 份豬糞便樣本作為本次研究對(duì)象，經(jīng)冷凍后送回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

（1）試劑：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院禽病教研室提供DH5a 大腸桿菌；TaKaRa 公司提供DL-2000 DNA Marker、RNase inhibitor、dNTPs、random primers p（N）6、pMD18-T vector、M-MLV、Olig（dT）18、Ex Taq 酶；Invitrogen公司提供Trlzol Reagent；TIANGEN公司提供瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒；其他試劑（異丙醇、氯仿等）均為分析純。

（2）合成引物：在全基因序列的5725～6452nt 片段上涉及引物（擴(kuò)增片段348bp）并由上海英駿公司合成（5725～6452nt 片段）：㈠外引物；㈡內(nèi)引物。

（3）豬戊型肝炎病毒檢測(cè)及序列分析方法：使用PBS 將糞便樣本配制獲得10%懸浮液，經(jīng)3 次反復(fù)凍融后以40℃狀態(tài)下經(jīng)8000r/min 離心10min，取上清液利用Trlzol Reagent 按照相關(guān)說(shuō)明書操作，經(jīng)9.5uL DEPC 處理后提取RNA 實(shí)施反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄過(guò)程應(yīng)在冰上操作，反應(yīng)體系共20uL，組成成分包括9.5uL 病毒RNA；1uL 反轉(zhuǎn)錄引物R/O；4uL、5 ×M -MLV Buffer；1uL、200U/uLM -MLV；0.5uL、40U/uL RNase inhibitor；4ul 2.5mmol/L each dNTPs，上述成分混合均勻后于40C 水浴1h后在冰上作用2min 直接PCR 或保存于-400C 條件下待用。PCR 反應(yīng)體系1（20uL）：2uL、10×MMLV Buffer；2uL dNTP；0.25uL、5U/ulL Ex Taq酶；2ulDNA 模板；0.5uL、20pmol/L M1；0.5uL、20pmol/L M2；13ul ddH2O，PPCR反應(yīng)體系2（50uL）：0.5uL、5U/uL Ex Taq 酶；1uL、20pmol/L M3；1uL、20pmol/L M4；4uL、10×M-MLV Buffer；4uL dNTP；35.5ul ddH2O；4uL PCR 反應(yīng)體系1 產(chǎn)物。兩輪PCR 于相同條件下反應(yīng)，即940C 條件下預(yù)變性5min，之后于940C 變性1min，530C 條件下退火45s，720C 延伸1min，共實(shí)施35 個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)結(jié)束后經(jīng)720C、10min 延伸。將5uL 第二輪PCR 產(chǎn)物實(shí)施瓊脂糖凝膠電泳（將1%瓊脂糖凝膠加入0.5ug/mL 溴化乙錠中），于紫外檢測(cè)儀下觀察HEV-RNA 檢測(cè)陽(yáng)性率，并利用DNAStar、MEGA4.1 生物學(xué)軟件對(duì)所得擴(kuò)增片段進(jìn)行序列分析確定基因型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS13.0 軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用t 檢驗(yàn)（由±s表示），計(jì)數(shù)資料采用X2檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

600 份豬糞便樣本中106 份經(jīng)檢測(cè)為HEVRNA 陽(yáng)性（陽(yáng)性率17.67%），494 份陰性（陰性率82.33%），陽(yáng)性樣本序列與基因IV 型相似度最高，對(duì)比結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。122 份陽(yáng)性樣本序列分析結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 122 份陽(yáng)性樣本序列分析（%）

3 討論

戊型肝炎病毒（HEV）屬于戊型肝炎病毒科（Hepeviridae）、戊型肝炎病毒屬（genus Hepevirus），呈球狀顆粒狀態(tài)（二十面體），直徑約32nm，是一種單股、無(wú)囊膜、正鏈RNA 病毒，由Meng 等人于1997年首次分離獲得[1]。

研究表明，目前臨床將HEV 分為五個(gè)基因型，即人感染HEV I 型、II 型，人畜共患HEV III 型、IV型，禽感染V 型。本文研究可知，雞西地區(qū)豬戊型肝炎病毒陽(yáng)性率較高（17.67%），且序列分析可知均屬于人畜共患IV 型HEV，與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)相關(guān)報(bào)道相符。提示畜牧工作者應(yīng)提高警惕，將預(yù)防及干預(yù)豬戊型肝炎病毒感染作為工作重點(diǎn)，采取多種有效措施降低豬感染戊型肝炎病毒幾率，阻斷人畜共患疾病傳播途徑，保障人們飲食健康及生活質(zhì)量。

[1]孫中鋒，金寧一，朱光澤，等.長(zhǎng)春地區(qū)人與豬戊型肝炎病毒分子流行病學(xué)及部分基因序列分析[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2013，22(10)：941.