乙型肝炎病毒表面抗原對實體腫瘤患者CIK細胞誘導培養及表型分析的影響

馬學斌，馬 聰，邱 偉，趙健靈，袁紅霞，楊 郡

乙型肝炎病毒表面抗原對實體腫瘤患者CIK細胞誘導培養及表型分析的影響

馬學斌，馬 聰，邱 偉，趙健靈，袁紅霞，楊 郡

目的探討乙型肝炎病毒表面抗原陽性患者與陰性患者細胞因子誘導的殺傷細胞（cytokine induced killer cells，CIK）體外培養過程中個細胞增殖情況和淋巴細胞亞群的變化。方法選取海軍總醫院2012年10月－2013年6月住院的腫瘤患者，共50例，根據乙型肝炎病毒表面抗原表達情況分為陰性組和陽性組。分別抽取患者外周血進行CIK細胞誘導培養，在第1、5、7、9、11、13、15天進行細胞活力檢測并計數，第5、7、10、13、15天進行各細胞亞群的表達分析。結果兩組患者CIK增殖情況單個時間點比較無顯著性差異，但是在第15天的增殖倍數陽性組顯著高于陰性組（280倍比180倍）；細胞亞群分析中CD3＋T細胞、CD8＋T細胞、CD3＋CD8＋T細胞、CD3＋CD56＋T細胞比例均隨培養時間延長而升高，CD4＋T細胞、CD3＋CD4＋T細胞隨培養時間延長而降低，陽性組更顯著；其中CD8＋T細胞和CD3＋CD4＋T細胞在兩組間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。結論乙型肝炎病毒表面抗原陽性患者CIK細胞較陰性患者擴增能力更強，效應細胞表型表達更有利于殺傷作用的發揮。

乙型肝炎病毒表面抗原；細胞因子誘導的殺傷細胞；細胞亞群

我國是乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）的高流行區，15～59歲人群HBV表面抗原（hepatitis B virus surface antigen，HBsAg）陽性率8.12%［1］，所有腫瘤患者血清HBsAg陽性率8.98%［2］。HBV感染是導致中國人群肝腫瘤發生的重要因素，同時也與其他腫瘤的發生發展具有很密切的關系。目前在對腫瘤進行的綜合治療中，細胞因子誘導的殺傷細胞（cytokine induced killer cells，CIK）是一種新型的免疫效應細胞，由于其在體外增殖速度快、殺瘤譜廣，對自體腫瘤細胞具有特異性識別能力，殺傷活性高不受主要組織相容性復合體限制，對正常骨髓前體細胞毒性很小，對多重耐藥腫瘤細胞同樣敏感，可以抵抗腫瘤細胞引發的Fas-FasL凋亡等特點，受到了廣泛的關注。有報道CIK細胞能夠明顯抑制HBV復制，安全無副作用［3］。但是對于HBsAg表達陽性與否對腫瘤患者外周血誘導培養的CIK細胞增殖能力及細胞表面分子表達的影響等，尚未見報道。本研究對此進行了初步分析，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取海軍總醫院2012年10月－2013年6月住院的中晚期惡性腫瘤患者50例，男性28例、女性22例，年齡（53.42±13.32）歲；其中，肺癌15例，肝癌10例，鼻咽癌7例，乳腺癌6例，胃癌3例，腎癌2例，宮頸癌2例，其他惡性腫瘤5例；所有患者均經過HBsAg、丙型肝炎病毒抗體、艾滋抗體和梅毒抗體檢測，所有患者除HBsAg檢測結果外，其他三項結果均為陰性。根據HBsAg檢測結果將研究對象分為陽性組（14例）和陰性組（36例）。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 3111型CO2培養箱（美國Thermo Fisher公司），4000型低速離心機（日本Kubota公司），BCM型生物潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司），Epics XL MCL型流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司），XE-2100全自動血液細胞分析儀（日本Sysmex公司），LX-20全自動生化分析儀（美國Beckman Coulter公司）。

1.2.2 試劑 無血清淋巴細胞培養液（GT-T551，日本Taraka公司），人淋巴細胞分離液（天津美德太平洋科技有限公司），D-磷酸緩沖液（Dulbecco′sphosphate buffered saline，D-PBS，日本Taraka公司），重組人源化白細胞介素-2（recombinant human interleukin-2，rhIL-2，北京雙露藥業公司），干擾素γ（Interferonγ，IFN-γ，上海凱茂生物醫藥有限公司），CD3單克隆抗體（古巴分子免疫學中心），CD3、 CD4、CD8、CD56熒光標記抗體（美國Beckman Coulter公司），全血細胞分析試劑（日本Sysmex公司），XL-2100全自動血液細胞分析儀配套試劑，生化檢測試劑（北京九強生物技術有限公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 治療前淋巴細胞數量及相關生化指標的比較 在患者抽血進行CIK細胞培養的同時，取患者外周乙二胺四乙酸二鉀（Ethylenediaminetetraacetic acid dipotassium，EDTA K2）抗凝靜脈血2 mL，使用全自動血液細胞分析儀檢測患者治療前淋巴細胞數量；同時，采集患者非抗凝靜脈血5 mL，待血液凝固后，離心分離血清，進行相關生化指標的檢測。

1.3.2 CIK細胞的體外培養流程 所有入組患者簽署知情同意書后，早晨空腹用真空采血管采集外周靜脈血54 mL，在GMP實驗室分離單個核細胞，用GT-T551無血清淋巴細胞培養液調整細胞濃度為1×106／mL，在每毫升細胞懸液中加入IFN-γ800 U／mL，加入10%的自體血漿，轉入用5μg／mL CD3單抗預先包被的培養瓶中，放置37℃，5%CO2培養箱中培養；第2天添加培養液并加入rhIL-2 1 000 U／mL，期間根據細胞生長情況補充GT-T551培養液和相應的rhIL-2和自體血漿；培養至第5天，根據細胞生長增殖情況調整細胞密度，并轉入GT-T610（A）透氣培養袋進行擴大培養，每2～3 d根據細胞的生長增殖情況，補充GT-T551淋巴細胞培養液、相應的rhIL-2和自體血漿。分別于培養后的第5、7、10、13、15天進行細胞表型分析，用胎盤藍染色法檢測細胞活力并計數；在培養的第13～15天，分3 d連續收集所有細胞，經洗滌后配成200mL的細胞懸液，加入適量的白蛋白和白介素-2（interleukin-2，IL-2），混勻后送病房給患者回輸。

1.3.3 流式細胞術檢測CIK細胞的淋巴細胞亞群

于CIK細胞培養的第5、7、10、13、15天分別采取培養的細胞，加入適量的異硫氰酸熒光素（Fluorescein Isothiocyanate，FITC）、藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）、或藻紅蛋白-花青苷5（phycoerythrin cyanin 5，PC5）標記的混合抗體，包括CD4-FITC／CD8-PE／CD3-PC5、CD3-FITC／CD56-PE。輕輕震蕩混勻后，室溫避光孵育20 min，加入PBS，顛倒混勻后1 500 r／min離心8 min，棄上清液，沉淀中加入適量PBS混懸細胞后，流式細胞儀檢測，每份樣本分析細胞數≥5× 104個，采集的數據使用流式細胞儀配套軟件進行分析。

1.3.4 統計學處理 采用SPSS 16.0統計軟件進行分析，計量資料均采用均數±標準差（ˉx±s）表示，計量數據組間比較采用單因素方差分析和多元方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般情況 兩組比較淋巴細胞、白蛋白、谷丙轉氨酶、總膽紅素、直接膽紅素 F分別為4.415、6.378、9.300、6.623、5.502，差異有統計學意義（P＜0.05，表1）。

表1 兩組一般情況

2.2 兩組患者CIK細胞增殖數量 在CIK細胞增殖培養的第1、5、7、9、11、13、15天分別混勻培養中的細胞，取樣檢測細胞活力和細胞密度，計算細胞總數。細胞活力均≥98%，細胞計數兩組比較差異無統計學意義（表2），細胞生長曲線見圖1。兩組患者CIK細胞的增殖，組間比較差異無統計學意義（P＞0.05），兩組CIK細胞均在第7天左右開始進入快速增長期；至培養檢測的第15天，兩組CIK細胞仍處于對數生長階段，但是陽性組細胞數約為初始的280倍，高于陰性組的180倍。

表2 兩組患者CIK細胞增殖數量（×107個）

圖1 兩組CIK細胞生長曲線

2.3 誘導培養過程中淋巴細胞亞群 在培養過程中，分別于第5、7、10、13、15天收取兩組患者的CIK細胞，檢測淋巴細胞表面表型的變化。結果顯示，兩組患者的CIK細胞中CD3＋T細胞、CD8＋T細胞、CD3＋CD8＋T細胞、CD3＋CD56＋T細胞比例均隨培養時間延長而呈升高的趨勢，其中陽性組升高較陰性組；CD4＋T細胞、CD3＋CD4＋T細胞隨培養時間延長而呈逐漸降低的過程，陽性組降低較陰性組更多（表3，圖2、3）。經多因素方差分析，結果顯示CD8＋T細胞比例的升高和CD3＋CD4＋T細胞比例的降低在兩組間的差異有統計學意義（P＜0.05）。

表3 不同培養時間兩組腫瘤患者CIK細胞的表型變化（%）

圖2 兩組單陽細胞比率隨時間延長的變化

圖3 兩組患者CIK細胞表型隨時間延長的變化

3 討論

免疫療法有助于獲得HBsAg血清學轉陰，恢復或改善缺陷的T細胞抗病毒免疫反應，CIK細胞治療對于HBV DNA復制具有抑制作用，CIK細胞回輸后可以使慢性乙型肝炎患者HBV DNA水平明顯下降，CIK細胞治療后患者病毒載量明顯下降者其CIK效應細胞CD3＋CD56＋T細胞比例明顯高于治療無應答者，提示免疫細胞數量和功能恢復與機體抗病毒能力的密切相關［4］。在腫瘤的發生發展過程中，多種因素影響腫瘤的發展和轉歸［5-6］。本研究在免疫細胞治療惡性腫瘤的臨床應用過程中發現，HBsAg陽性表達者在細胞回輸治療中的效果似乎要優于HBsAg陰性表達者，為了深入研究HBsAg血清學水平對CIK細胞增殖的影響，我們對在海軍總醫院進行生物治療的50例腫瘤患者的CIK細胞培養過程中的原始數據進行初步的分析研究。

對于入組患者初始的淋巴細胞計數，陽性組的數量要顯著的低于陰性患者，且陽性組患者的白蛋白、谷丙轉氨酶、總膽紅素和直接膽紅素水平都要顯著高于陰性組患者的平均水平，顯示了HBsAg陽性表達對于患者的一般狀況是一個負性的影響，這與HBV的存在會影響人體的健康狀況是一致的［7-8］。對于來自組兩組患者的CIK細胞的增殖情況，結果顯示不論是HBsAg陽性或者陰性，CIK細胞的增殖都是大約從第7天開始進入快速增長期，在細胞數量的增殖上相同時間點兩組比較沒有顯著性差異，但是第15天陽性組細胞的增殖倍數較第1天要高于陰性組（280倍比180倍），對于這一原因的分析認為陽性組患者的淋巴細胞除與腫瘤細胞接觸被活化和識別外，還與HBV有接觸，接受雙重的刺激和激活，從而推測其可能具有更強的識別能力和殺傷活性［9］，在體外受到進一步的刺激和活化時，更容易生長和增殖，因此在第15天的增殖倍數陽性組要顯著高于陰性組。

對淋巴細胞表面標志的研究結果，CD3＋T細胞、CD8＋T細胞、CD3＋CD8＋T細胞、CD3＋CD56＋T細胞均隨著培養時間延長而升高，升高程度陽性組優于陰性組；CD4＋T細胞、CD3＋CD4＋T細胞隨著培養時間的延長而降低，降低程度陽性組優于陰性組。經過多元方差分析，其中差異有統計學意義的是CD8＋T細胞和CD3＋CD4＋T細胞（P＜0.05），其余差異沒有統計學意義。對于這一現象的分析，由于在CIK這個異質性細胞群中，主要的效應細胞是CD3＋CD8＋T細胞和CD3＋CD56＋T細胞，在陽性組中CD3＋CD8＋T細胞升高較陰性組更為顯著；而CD3＋CD4＋T細胞屬于抑制細胞，對于CIK細胞發揮殺傷作用具有抑制作用［10］，因此在培養過程中，把CD3＋CD4＋降到最低是提高效應細胞殺傷活性的重要環節，通過我們的研究分析可以看出，在陽性患者組中，CD3＋CD4＋T細胞的比例降低較陰性組更為顯著，這為HBsAg陽性患者CIK細胞回輸后具有更好的治療效果提供了理論依據。關于CIK細胞培養技術，也有認為白介素-6的加入可以降低其中抑制細胞的比例，增加效應細胞的增值和毒性［11］，具有更好的效果。

免疫治療對于惡性腫瘤及HBV的治療都是一種很有前途的治療策略［12-15］，如何有效地提高治療效果，更好地發揮其抗腫瘤和抗病毒作用，將是這一領域的研究熱點，我們的分析研究樣本有限，還需要進一步擴大樣本深入研究。

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Effects of hepatis B vines on the grow th and cell subsets analysis of cytokine-induced killer cells（CIK）in vitro incubation from tumor

MA Xuebin1，2，MA Cong1，2，QIUWei1，ZHAO Jianling1，YUAN Hongxia1，YANG Jun1
（1.Biology Treatment Center，Navy General Hospital，Beijing 100048，Chin；2.Department of Laboratory，Navy General Hospital，Beijing 100048，China）

ObjectiveTo explore the difference of the immune cell subsets during the process of cytokine-induced kill cells（CIK）incubation from tumor patients with and without hepatitis B virus.MethodsThe peripheral blood was extracted from 50 tumor patients from Oct 2012 to Jun 2013 who were divided into two groups by with or without hepatitis B virus.The proliferate velocity and activity of CIK cellswere detected by count on 1，5，7，9，11，13 and 15 days of the CIK culture.The expressions of CD3＋，CD4＋，CD8＋，CD3＋CD8＋，CD3＋CD4＋，CD3＋CD56＋T cells were analyzed by flow cytometry on 5，7，10，13 and 15 days of the culture.ResultsThe proliferative multiple at15 days in HBV positive group was higher than that of negative group（280 vs.180），although there was no significant difference between the two groups at the same culturing time points. The frequencies of CD3＋T cells，CD8＋T cells，CD3＋CD8＋T cells and CD3＋CD56＋T cells increased by the time，whilethe CD4＋T cells and CD3＋CD4＋T cells decreased by the time，the positive group was more than the negative.Among them，the difference of CD8＋T cells and CD3＋CD4＋T cells in two groups was significant（P＜0.05）.ConclusionThe proliferate multiple capacity of CIK cells from patients with HBV positive group was better than that of negative group，and the immune cell subsets states of HBV positive group was better than that of negative group..

Hepatitis B virus surface antigen；Cytokine-induced killer cells；Immune cell subset

R392.11；R392.12

B

2095-3097（2014）01-0022-05

10.3969／j.issn.2095-3097.2014.01.006

2013-06-30 本文編輯：馮 博）

100048北京，海軍總醫院生物治療中心（馬學斌，馬 聰，邱 偉，趙健靈，袁紅霞，楊 郡），檢驗科（馬學斌，馬 聰）

馬 聰，E-mail：macong958166＠163.com