誘導(dǎo)子在人參細胞培養(yǎng)中的應(yīng)用研究進展

梁瑩，張美萍，孫春玉，蔣世翠，王義，張斯童，紀東輝

(吉林農(nóng)業(yè)大學，長春130118)

人參(PanaxginsengC.A.Mey)是我國古老而名貴的藥用植物，人參皂苷是人參的主要有效成分，具有保護心臟、提高免疫力、抗疲勞、保護肝臟等廣泛的藥理作用[1]，但人參皂苷含量很低，且尚未實現(xiàn)人工合成，通常大田栽培獲得的人參中含量僅為3%左右[2]。采用植物細胞培養(yǎng)手段實現(xiàn)人參皂苷的快速、大量積累是克服大田栽培周期長、對栽培環(huán)境要求苛刻的最有效手段。因此，應(yīng)用生物學等手段進行有目的地調(diào)控人參皂苷的生物合成已受到越來越多學者們的關(guān)注。

從細胞培養(yǎng)的角度講，誘導(dǎo)子(elicitor)是指對植物細胞目的產(chǎn)物產(chǎn)生促進作用的因子。從植物病理學的角度講，是指在植物抗病過程中，能誘發(fā)植物產(chǎn)生植物抗毒素和引起植物過敏反應(yīng)，包括侵染植物的微生物及植物細胞內(nèi)的分子。誘導(dǎo)子在植物與微生物之間相互作用，能快速、專一性地誘導(dǎo)特定基因的表達[3]。眾多研究表明，誘導(dǎo)子能夠有效地調(diào)控植物細胞次生代謝產(chǎn)物的合成，并能促進其分泌到培養(yǎng)基中[4]。人參皂苷作為人參屬植物的一種次生代謝產(chǎn)物，是研究植物次生代謝信號識別及其細胞內(nèi)信息傳遞的良好實驗體系。利用誘導(dǎo)子處理人參細胞培養(yǎng)物，促進次生代謝產(chǎn)物的合成，已成為國內(nèi)、外學者們廣泛重視的新方法。本文就各種誘導(dǎo)子對人參細胞培養(yǎng)生產(chǎn)皂苷的最新研究進展進行綜述。

1 誘導(dǎo)子的分類

從植物的防衛(wèi)反應(yīng)角度不同來劃分，誘導(dǎo)子可分為外源誘導(dǎo)子(exogenous elicitor)和內(nèi)源誘導(dǎo)子(endogenous elicitor)。外源誘導(dǎo)子是指植物細胞細胞壁的果膠多糖類等來自植物細胞的誘導(dǎo)子；內(nèi)源誘導(dǎo)子是指各種病原菌分泌的代謝物等來自植物細胞外的誘導(dǎo)子。從誘導(dǎo)子特異性方面劃分，可分為特異性誘導(dǎo)子(specificity elicitor)和非特異性誘導(dǎo)子(non-specificity elicitor)。從化學組成上劃分，誘導(dǎo)子可分為蛋白質(zhì)類誘導(dǎo)子、多糖類誘導(dǎo)子、多肽類誘導(dǎo)子及脂類誘導(dǎo)子。從來源上劃分，誘導(dǎo)子可分為生物誘導(dǎo)子(biotic elicitor)和非生物誘導(dǎo)子(abiotic elicitor)[5]。生物誘導(dǎo)子是指植物在防御過程中為了對抗微生物感染所產(chǎn)生的物質(zhì)，包括各種病原菌(細菌、真菌、酵母及病毒等)、植物細胞分離物和代謝物、降解細胞壁的酶類以及培養(yǎng)物濾液中的成分，其中主要為細胞壁水解物；非生物誘導(dǎo)子是指能起到誘導(dǎo)作用的紫外線、輻射、凍融等物理因子和乙烯、氯仿、重金屬鹽類、殺真菌劑、去污劑等化學因子[6]。

本文主要從生物誘導(dǎo)子和非生物誘導(dǎo)子的角度綜述不同來源的誘導(dǎo)子在人參皂苷合成中的應(yīng)用。

2 生物誘導(dǎo)子在人參皂苷合成研究中的應(yīng)用

2.1真菌誘導(dǎo)子

真菌誘導(dǎo)子來源于真菌，能引起植物細胞合成并能快速、專一地促進植物次生代謝產(chǎn)物積累。近年來，關(guān)于真菌誘導(dǎo)子誘導(dǎo)人參細胞培養(yǎng)物中人參皂苷積累的研究屢見報道[7]。

隋昌海等[8]以人參根際優(yōu)勢菌種地球囊霉作為誘導(dǎo)子來提高人參培養(yǎng)物中人參皂苷的含量發(fā)現(xiàn)，在人參愈傷組織生長第21天(即對數(shù)生長期晚期)加入濃度為0.10mg/mL的誘導(dǎo)子，皂苷含量達到3.6%，是對照組的1.63倍。

劉峻等[9]選擇不同濃度的棉花枯萎病菌、黑曲霉、黃瓜碳疽病菌及青菜炭疽病菌作為誘導(dǎo)子，研究其對人參發(fā)狀根生長及皂苷合成的影響。結(jié)果表明，濃度為40mg/L～800mg/L的棉花枯萎病菌能抑制發(fā)狀根的生長及皂苷合成；20mg/L的黑曲霉能夠促進總皂苷合成，是對照組的1.46倍，且濃度在20mg/L～400mg/L的范圍內(nèi)均可促進發(fā)狀根的生長；濃度為800mg/L時，黃瓜炭疽病菌可促進總皂苷的合成，總苷含量為3.636%，是對照組的1.46倍，但此濃度抑制發(fā)狀根的生長；青菜炭疽病菌在40mg/L～800mg/L的濃度范圍內(nèi)對發(fā)狀根的生長呈抑制作用，但對總皂苷合成有促進作用。

劉長軍等[10]分別用黑曲霉、尖孢鐮刀菌、刺盤孢菌和莖點屬菌菌絲體制備誘導(dǎo)子，添加于人參懸浮培養(yǎng)細胞中，研究不同濃度的誘導(dǎo)子對人參皂苷合成量的影響，結(jié)果表明，在人參細胞懸浮培養(yǎng)初期加入20μg/mL的黑曲霉，培養(yǎng)23d后收獲，皂苷含量可提高到細胞干重的6.8%，是對照組的1.3倍。在人參懸浮細胞培養(yǎng)的第15天分別加入4種誘導(dǎo)子發(fā)現(xiàn)，各組中人參皂苷積累時間分別較對照組提前了2d～4d，縮短了培養(yǎng)時間，同時提高了皂苷產(chǎn)率。添加真菌誘導(dǎo)子后的培養(yǎng)基中，皂苷含量明顯高于對照，占細胞總量的80%以上，其中用刺盤孢菌菌絲體處理后的培養(yǎng)基中皂苷含量達到179mg/L，是對照組的1.2倍。這說明真菌誘導(dǎo)子能夠促進人參皂苷的外排，對人參皂苷的大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)中產(chǎn)物的連續(xù)回收和節(jié)約成本十分有利。

2.2酵母提取物

酵母提取物(Yeast Extract，YE)是指酵母經(jīng)破壁后將其中蛋白質(zhì)、核酸、維生素等抽提，再經(jīng)生物酶解的富含小分子的氨基酸、肽、核苷酸、維生素等天然活性成分的物質(zhì)。YE是植物細胞培養(yǎng)中常用的誘導(dǎo)子，能誘導(dǎo)或促進植物次生代謝產(chǎn)物的形成。

周倩耘等[11]研究了YE對人參發(fā)狀根中皂苷含量的影響，結(jié)果顯示，在培養(yǎng)基中添加0.10mg/mL的YE，總皂苷含量為3.595%，是對照組的1.57倍，Rg1、Re、Rb1、Rd含量分別為0.192%、0.189%、0.231%、0.108%，分別是對照組的1.35倍、1.42倍、1.28倍和1.29倍，培養(yǎng)基中總皂苷含量為0.025%。這說明YE不僅能促進人參發(fā)狀根中總皂苷和單體皂苷的積累，還能促進人參皂苷的外排，推測可能是由于YE中的Zn2+、Ca2+等陽離子及寡糖素影響了次生代謝產(chǎn)物的調(diào)控[12]。

K.MCY等[13]在人參細胞懸浮培養(yǎng)液中添加酵母誘導(dǎo)子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)酵母誘導(dǎo)子誘導(dǎo)的新鮮細胞中能產(chǎn)生一種新的化合物2，5-二羥基-1，4-苯醌(2，5-dinethoxy-1，4-benzoquinone)，且在12h時達到最高水平(65.10μg/g±4.96μg/g)。

3 非生物誘導(dǎo)子在人參皂苷生物合成中的應(yīng)用

3.1茉莉酸甲酯

茉莉酸甲酯(MeJA)是茉莉酸類植物內(nèi)源激素，作為植物體內(nèi)的一種生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，在次生代謝物合成中起著重要的調(diào)節(jié)作用。MeJA是一類特殊的環(huán)戊烷衍生物型植物激素，調(diào)節(jié)次生代謝產(chǎn)物生物合成的一系列酶促反應(yīng)。

義7-6塊主力含油層系為下第三系沙河街組沙三段9砂組。油藏平均埋深3 500m。砂層組厚度一般20～40m，砂體呈東南-西北向條帶狀展布，橫向?qū)挾仍?km左右，為單一水道。義7-6塊位于水道的邊部。該區(qū)塊油井滲透率差異較大，中心部儲層條件較好的油井測井滲透率可達35×10-3μm2，邊部的滲透率為（3～15）×10-3μm2，屬中孔、（特）低滲儲層。義7-6塊沙三下儲層類型類似樊142塊，滲透率較樊142塊低，井距較樊142塊大，注水見效慢，因此根據(jù)儲層特性優(yōu)化井網(wǎng)、井距，并與壓裂規(guī)模的合理匹配是直井長縫開發(fā)的關(guān)鍵。

王士杰等[1]研究發(fā)現(xiàn)，MeJA能夠促進人參發(fā)狀根的生長，通過向培養(yǎng)物中添加10μmol/L、100μmol/L、200μmol/L和500μmol/L的MeJA，確定了濃度在200μmol/L時誘導(dǎo)10d效果最好，人參發(fā)根生物量增長13.82倍，總皂苷含量達到了2.28%，比對照組高35.71%。

徐立新等[14]通過實驗表明，MeJA在較低濃度的時候?qū)傇碥盏姆e累和人參發(fā)根的生長有促進作用。當其濃度為0.001mmol/L時，總皂苷產(chǎn)量為0.120 7g/L。其中Rb1產(chǎn)量為11.41mg/L。升高MeJA濃度為1.000mmol/L時，Rb1產(chǎn)量僅為6.5mg/L。

沈旭等[15]的研究結(jié)果表明，在人參懸浮細胞培養(yǎng)第7天分別添加10μM、100μM、200μM、400μM的MeJA，培養(yǎng)11d收獲，測得MeJA對人參懸浮細胞的生長有不同程度的抑制作用，并且抑制程度隨著添加濃度的上升而上升，但是次生代謝產(chǎn)物的含量卻隨之而上升。進一步研究發(fā)現(xiàn)，第7天添加100μM的MeJA能夠促進人參細胞單體皂苷含量的提高。

3.2水楊酸

水楊酸(Salicylic acid，SA)即鄰羥基苯甲酸，廣泛存在于高等植物體內(nèi)。有研究表明，SA不僅參與植物體內(nèi)的許多生理過程，還與植物抗病反應(yīng)關(guān)系密切，可被看作為一種新的植物激素。

徐立新[14]等在人參毛狀根培養(yǎng)中添加SA，探討不同濃度的SA對人參總皂苷和單體皂苷含量的影響結(jié)果表明，SA的添加對人參發(fā)狀根中總皂苷的積累無明顯促進作用，且隨著SA濃度的增大，對皂苷的合成顯示了抑制作用，當SA濃度為0.100mmol/L時，總皂苷含量最高(0.1008g/L)；適當濃度的SA能促進Rb1的積累，當SA濃度為0.100mmol/L時，Rb1產(chǎn)量最高(11.49mg/L)。

張悅等[18]研究了不同濃度的SA對人參愈傷組織培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明，在愈傷組織培養(yǎng)的第28天添加0.001mg/L的SA，培養(yǎng)35d后收獲，皂苷含量達到3.5%，是對照組的1.3倍。實驗證明了SA影響人參培養(yǎng)物的過氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶活力。向愈傷組織中添加SA，作用14h后過氧化物酶(POD)的活力開始發(fā)生變化，24h酶活力最佳，是對照組的1.5倍，隨后活性開始下降，72h后與對照組基本接近；添加SA 18h后，多酚氧化酶活力達到最高值，48h后人參培養(yǎng)物中多酚氧化酶的活力仍然高于對照；添加SA的24h內(nèi)人參愈傷組織中的苯丙氨酸解氨酶的活力低于對照組，24h后迅速升高，48h活力達到最大值，是對照的1.87倍。

3.3重金屬鹽類

重金屬鹽(銅、鉛、鋅、鐵、鈷、鎘等)屬于無機誘導(dǎo)劑中的一類，能夠影響、調(diào)控植物次生代謝產(chǎn)物合成。與其他誘導(dǎo)劑相比，重金屬鹽類來源廣泛、操作簡單、經(jīng)濟性較好[19]。

黃超等[20]研究了釩酸鹽對人參細胞懸浮培養(yǎng)中皂苷合成的影響。在細胞培養(yǎng)的第4天添加50μM的釩酸鹽(NH4VO3)，皂苷含量達到499.3μg/100mg DW。同時，研究了在皂苷合成中2個關(guān)鍵酶UGRdGT和P6H的變化情況。這2個皂苷合成關(guān)鍵酶的酶活性在釩酸鹽加入后有顯著的增加，并同時在細胞培養(yǎng)的第6天達到了最大值。添加誘導(dǎo)子作用后的第4天～第10天內(nèi)，UGRdGT和P6H的酶活性都明顯高于對照組。結(jié)合實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)，分析了經(jīng)釩酸鹽誘導(dǎo)后的第6h、12h、24h和48h后的基因轉(zhuǎn)錄水平的實時變化情況。結(jié)果表明，經(jīng)釩酸鹽誘導(dǎo)后，4個基因的轉(zhuǎn)錄水平都有顯著的增加。添加誘導(dǎo)子12h后，鯊烯合成酶(Squalene synthetase，SQS)、鯊烯環(huán)氧酶(Squalene epoxidase，SQE)和達瑪烷合成酶(Dammarenediol synthase，DS)的轉(zhuǎn)錄水平分別是對照組的7.6倍、10.3倍和17.8倍。12h～36h內(nèi)，SQS的基因轉(zhuǎn)錄水平與對照組相比沒有明顯差異，而SQE的基因轉(zhuǎn)錄水平仍然顯著高于對照組。在6h～48h內(nèi)，環(huán)阿屯醇合成酶(Cycloartenol Synthase，CAS)的基因轉(zhuǎn)錄水平與對照組沒有明顯變化。人參皂苷合成關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平的快速上調(diào)促進了皂苷合成。

4 展望

在適宜條件下，通過添加誘導(dǎo)子來提高植物細胞中有益次生代謝物的含量，特別是運用誘導(dǎo)子手段調(diào)控人參皂苷代謝途徑，提高人參細胞培養(yǎng)物中人參皂苷的含量，具有良好的經(jīng)濟和社會效益。目前對于誘導(dǎo)子在人參細胞培養(yǎng)中的應(yīng)用研究取得了一定進展，但還存在一些不夠完善的地方，例如誘導(dǎo)子和代謝產(chǎn)物之間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系、誘導(dǎo)子受體的提取純化等，這些問題導(dǎo)致了誘導(dǎo)子作用機制的不確切性，如果上述問題能有效地解決，就可用現(xiàn)代分子技術(shù)在分子水平上闡明人參皂苷的合成機制，為今后的誘導(dǎo)培養(yǎng)人參細胞提供可靠的理論依據(jù)。

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