秀麗隱桿線蟲膽固醇7，8-脫氫酶在大腸桿菌中的表達

格日勒，申雁冰，任佳佳，湯 睿，王 敏

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

秀麗隱桿線蟲膽固醇7，8-脫氫酶在大腸桿菌中的表達

格日勒，申雁冰，任佳佳，湯 睿，王 敏

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

膽固醇7，8–脫氫酶是參與膽固醇代謝的還原酶，可以將膽固醇轉化為7–脫氫膽固醇(合成維生素D3的重要中間體)．合成秀麗隱桿線蟲的膽固醇7，8-脫氫酶基因daf-36，與具有T7強啟動子的載體pET32a(+)連接后，成功構建pET32a-daf-36表達質粒，轉入大腸桿菌表達系統(tǒng)E. coli BL21(DE3)和E. coli Rosetta(DE3)，經過IPTG誘導培養(yǎng)，蛋白質電泳圖譜及質譜結果表明此酶得到了高效表達．

膽固醇7，8–脫氫酶基因daf-36；基因克隆；大腸桿菌；蛋白質表達

膽固醇7，8–脫氫酶(cholesterol 7，8-dehydrogenase)是參與膽固醇代謝的一種氧化還原酶，可以將膽固醇轉化為7–脫氫膽固醇．7–脫氫膽固醇是合成維生素D3的重要中間體．隨著世界人口的不斷增加和各國國民經濟的發(fā)展以及人們生活水平的提高，市場對維生素D3的需求量不斷上升[1]．目前維生素D3的生產難點在于其前體物7–脫氫膽固醇的合成[2].中國科學院原感光化學研究所于20世紀90年代初提出一條7–脫氫膽固醇的化學合成路線，并取得了較好的實驗結果[3]；但該合成路線中化學反應步驟多，涉及許多有機試劑的使用，條件不易控制，且副產物多，轉化效率低，環(huán)境污染嚴重．尋求能夠替代化學法的維生素D3生物合成技術是目前研究的熱點[4]．有研究[5]發(fā)現(xiàn)，一些動物的組織和器官在體內和體外合適條件下可將膽固醇直接轉化為7–脫氫膽固醇．經研究發(fā)現(xiàn)在家蠶前胸腺中表達并命名的neverland基因(nvd-Bm)與膽固醇7，8–脫氫酶相關，并且在果蠅中證實存在有功能類似neverland基因(nvd-Dm)[6]．Niwa等[7]研究表明，該基因對合成蛻皮激素的中間產物7–脫氫膽固醇至關重要，Rottiers等[8]發(fā)現(xiàn)，秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)在合成dafachronic acid過程中，也有此功能類似的daf-36基因．本文嘗試利用基因工程技術實現(xiàn)膽固醇7，8-脫氫酶daf-36在大腸桿菌中的高效表達．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質粒

菌種E. coli DH5α、E. coli BL21(DE3)和E.,coli Rosetta(DE3)及質粒pET32a(+)由天津科技大學微生物制藥研究室保存．實驗中使用pET系列載體通用引物T7和T7ter由華大基因公司合成．

1.1.2 主要試劑和儀器

Taq DNA聚合酶、限制性內切酶Hind Ⅲ和EcoRⅠ、T4連接酶、DNA marker、蛋白marker，大連寶生物技術有限公司；提取質粒試劑盒，北京莊盟國際生物基因科技有限公司；凝膠回收試劑盒，北京天恩澤基因科技有限公司．

PCR儀，Thermo公司；凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司；紫外可見分光光度計，島津儀器(蘇州)有限公司；超聲細胞破碎儀，寧波新芝生物技術股份有限公司．

1.2 目的基因daf-36的獲取

從NCBI數(shù)據庫中獲得秀麗隱桿線蟲的基因daf-36序列登錄號：NM_073,228.4．首先進行大腸桿菌偏愛型密碼子的優(yōu)化，提交金唯智基因公司合成，然后連接在載體pUC57上，構建pUC57-daf-36重組質粒．

1.3 表達載體pET32a-daf-36的構建

將pUC57-daf-36重組質粒經內切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后，膠回收的daf-36與同樣處理過的pET32a(+)在T4連接酶的作用下進行連接，按照載體與插入片段物質的量比為1∶3的比例配制連接體系，16,℃連接12,h，獲得表達載體pET32a-daf-36，然后采用化學轉化法轉入E. coli DH5α 感受態(tài)中．挑取單克隆于含有100,μg/mL氨芐抗生素的5,mL LB培養(yǎng)液中，37,℃過夜培養(yǎng)．取菌液，使用pET系列載體通用引物T7和T7ter進行PCR驗證，小量提取質粒，限制性內切酶Hind Ⅲ和EcoRⅠ酶切驗證正確后，送往華大基因公司測序．

1.4 工程菌株的構建

選取測序驗證正確的重組質粒，采用化學轉化法轉入表達宿主E. coli BL21(DE3)和E. coli Rosetta (DE3)，挑取單克隆于含有100,μg/mL氨芐抗生素的5,mL LB培養(yǎng)液中，37,℃過夜培養(yǎng)．取菌液進行PCR驗證，獲得大腸桿菌工程菌株，命名為E.,coli BL21 (DE3)-daf-36和E.,coli Rosetta(DE3)-daf-36．

1.5 工程菌的表達

將大腸桿菌工程菌株E.,coli BL21(DE3)-daf-36和E.,coli Rosetta(DE3)-daf-36過夜培養(yǎng)，以1%接種量接入含有100,μg/mL氨芐抗生素的50,mL LB培養(yǎng)液中，37,℃、180,r/min培養(yǎng)至600,nm吸光度約0.6；加入終濃度為1,mmol/L的IPTG溶液，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)5,h，收集菌體；將其超聲破碎，分別取破碎后上清液、沉淀樣品，用SDS-PAGE檢測確定蛋白的表達形式．

1.6 蛋白質譜分析

取1,mL經誘導培養(yǎng)的工程菌株培養(yǎng)液，離心收集菌體，SDS-PAGE(分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%)檢測蛋白的表達情況，電泳結束后，室溫條件下，用考馬斯亮藍R250染色2,h，過夜脫色．選取與目的蛋白相對分子質量(含Trx融合標簽)相符合的蛋白條帶，用手術刀將膠切成1,mm3左右膠塊，置于1.5,mL Eppendorf管中，用200,μL雙蒸水洗2次，每次10,min，經胰蛋白酶(Trypsin)酶解后用Thermo LTQ XL蛋白質譜儀分析，離子源為NSI，毛細管電壓3.5,kV，離子源溫度260,℃，脫溶劑氣溫度260,℃，檢測器電壓200,V．HPLC流動相A液為體積分數(shù)0.1%的FA水溶液(水為質譜級)，B液為體積分數(shù)0.1%的FA乙腈溶液(乙腈為質譜級)；流量200,μL/min，梯度洗脫120,min．

2 結果與分析

2.1 表達載體的構建

從已構建好的pUC57-daf-36重組質粒中用限制性內切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ切下daf-36片段，插入pET32a(+)載體，質粒構建見圖1．

挑取單克隆接種至含有100,μg/mL氨芐抗生素的5,mL LB培養(yǎng)液中，37,℃、180 r/min過夜培養(yǎng)后，保存甘油菌，并取適量菌液，使用通用引物進行PCR鑒定．菌液PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖2(a))，目的條帶在2,100,bp左右，與預期相符，小量提取該菌株的質粒，使用限制性內切酶進行雙酶切鑒定．雙酶切后的表達載體pET32a-daf-36電泳結果(圖2(b))顯示5,900,bp為載體條帶，1,287,bp為目標條帶，其條帶數(shù)量和大小均符合要求．測序結果表明目的片段的序列符合度為100%，表明成功構建得到表達載體pET32a-daf-36．

2.2 工程菌株的構建

挑取單克隆于含有100,μg/mL氨芐抗生素的5,mL LB培養(yǎng)液中，37,℃過夜培養(yǎng)．取菌液用通用引物T7和T7ter進行PCR驗證，經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖3)，目的條帶在2,100,bp左右，與預期相符．這表明工程菌株E.,coli BL21(DE3)-daf-36和E.,coli Rosetta(DE3)-daf-36構建成功．

2.3 工程菌E.,coli BL21(DE3)-daf-36和E.,coli Rosetta(DE3)-daf-36的蛋白表達

根據NCBI報道[9]，目的蛋白含有428個氨基酸，相對分子質量約為4.955×104，載體的融合標簽相對分子質量約為1.6×104．

工程菌E. coli BL21(DE3)-daf-36采用1,mmol/L的IPTG溶液37,℃誘導5,h，SDS-PAGE電泳檢測，結果如圖4所示．在圖4(a)中，誘導后樣品在6.6× 104處有特異性條帶，且條帶較粗，實現(xiàn)了目的蛋白的高效表達．在圖4(b)中，沉淀樣品中存在目的蛋白，上清中基本沒有，初步確定蛋白以包涵體式存在于沉淀中，基本不可溶．

包涵體是由于蛋白表達量高、表達速度快等原因造成無法正確折疊而形成的，而E.,coli Rosetta(DE3)是Lac透性酶突變菌株，可以控制表達水平，并提供稀有密碼子tRNAs，故選擇其作為宿主菌，以期降低目的蛋白表達量．

工程菌E.,coli Rosetta(DE3)-daf-36采用1,mmol/L的IPTG溶液37,℃誘導5,h，SDS-PAGE電泳檢測，結果如圖5所示．誘導后目的蛋白獲得了高效表達，但大部分存在于沉淀中，初步確定蛋白以包涵體式存在于沉淀中，基本不可溶．

2.4 蛋白質譜分析

蛋白質譜結果如圖6所示，工程菌表達蛋白與理論序列覆蓋率為67%，證明與NCBI中報道[9]的一致，與Yoshiyama-Yanagawa等[10]報道的在果蠅S2細胞中表達的有催化能力的膽固醇7，8–脫氫酶蛋白序列也一致，進一步證明表達的蛋白為膽固醇7，8–脫氫酶．

3 討 論

目前對于膽固醇7，8–脫氫酶的研究主要集中在酶源發(fā)現(xiàn)與功能．本研究選擇了來源于秀麗隱桿線蟲中的膽固醇7，8–脫氫酶基因daf-36，并進行密碼子優(yōu)化后全序列合成，嘗試了兩種不同類型菌株作為宿主菌，均提高了該酶外源表達的表達量，其中E.,coli Rosetta(DE3)-daf-36表達量較高．外源基因在大腸桿菌中高效表達時通常主要以不溶性的包涵體形式存在[11–12]．包涵體是致密的不溶性蛋白和RNA的凝聚體，此時的蛋白質往往缺乏活性[13]．本實驗中獲得的膽固醇7，8–脫氫酶也是包涵體的形式，推測原因可能是其合成速度較快，影響其正確折疊．此外，宿主細胞內的還原性環(huán)境也可能影響該酶中二硫

鍵的形成．在后續(xù)的研究中，將嘗試包涵體的溶解與復性，或者更換酵母菌等真核表達系統(tǒng)，在實現(xiàn)其表達的前提下，提高酶的活性．

［1］ Ferguson G W，Gehrmann W H，Karsten K B，et al. Ultraviolet exposure and vitamin D synthesis in a sundwelling and a shade-dwelling species of Anolis：Are there adaptations for lower ultraviolet B and dietary vitamin D3availability in the shade?[J]. Physiological and Biochemical Zoology，2005，78(2)：193–200.

［2］ 張建成. 維生素D3生產新工藝[J]. 精細與專用化學品，2000，8(8)：23–24.

［3］ 韋昌金，譚天偉. 維生素D3合成新工藝的初步設想[J]. 化工進展，2003，22(10)：1098–1101.

［4］ 夏小斌，吳孔陽，李湘萍，等. 生物法合成7–脫氫膽固醇研究進展[J]. 食品工業(yè)科技，2009(11)：339–342.

［5］ 黃時海，何鑫平，于配配，等. 蝦Y–器官7、8–脫氫酶轉化膽固醇為7–脫氫膽固醇研究[J]. 安徽農業(yè)科學，2011，39(25)：15397–15399.

［6］ Namiki T，Niwa R，Sakudoh T，et al. Cytochrome P450 CYP307A1/Spook：A regulator for ecdysone synthesis in insects[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2005，337(1)：367-374.

［7］ Niwa R，Matsuda T，Yoshiyama T，et al. CYP306A1，a cytochrome P450 enzyme，CYP306A1，a cytochrome P450 enzyme，is essential for ecdysteroid biosynthesis in the prothoracic glands ofBombyxand Drosophila[J]. The Journal of Biological Chemistry，2004，279(34)：35942–35949.

［8］ Rottiers V，Motola D L，Gerisch B，et al. Hormonal control ofC. elegansdauer formation and life span by a Rieske-like oxygenase[J]. Development Cell，2006，10(4)：473–482.

［9］ Wollam J，Magomedova L，Magner D B，et al. The Rieske oxygenase DAF-36 functions as a cholesterol 7-desaturase in steroidogenic pathways governing longevity[J]. Aging Cell，2011，10(5)：879–884.

［10］ Yoshiyama-Yanagawa T，Enya S，Shimada-Niwa Y，et al. The conserved Rieske oxygenase DAF-36/Neverland is a novel cholesterol-metabolizing enzyme[J]. The Journal of Biological Chemistry，2011，286(29)：25756–25762.

［11］ Von Coelln R，Thomas B，Andrabi S A，et al. Inclusion body formation and neurodegeneration are parkin independent in a mouse model of α-synucleinopathy[J]. The Journal of Neuroscience，2006，26(14)：3685–3696.

［12］ A Villaverde，M M Carrió. Protein aggregation in recombinant bacteria：Biological role of inclusion bodies[J]. Biotechnology Letters，2003，25(17)：1385–1395.

［13］ 王增，馬會勤，張文，等. 包涵體蛋白的分離和色譜法體外復性純化研究進展[J]. 中國生物工程雜志，2009，29(7)：102–107.

責任編輯：周建軍

Expresion of cholesterol 7，8-dehydrogenase of Caenorhabditis elegans in E. coli

GE Rile，SHEN Yanbin，REN Jiajia，TANG Rui，WANG Min
(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

Cholesterol 7，8-dehydrogenase DAF-36 is a key enzyme involved in cholesterol metabolism. In this study，daf-36 gene fromCaenorhabditis eleganswas synthesized. The subcloned daf-36 pET-32a(＋)was to construct the expression plasmid pET32a-daf-36. The recombined plasmid was then transformed into E．coli BL21(DE3)and E. coli Rosetta(DE3). The results of SDS-PAGE and MS showed that the enzyme could be efficiently expressed in the recombined bacteria after being induced by IPTG.

cholesterol 7，8-dehydrogenase gene daf-36；gene cloning；E．coli；protein expression

Q-786

A

1672-6510(2014)05-0024-05

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.05.006

2013–12–08；

2014–01–26

國家高技術研究發(fā)展計劃“863計劃”資助項目(2011AA02A211)；國家自然科學基金資助項目(21276196)

格日勒（1988—），女(蒙古族)，內蒙古呼和浩特人，碩士研究生；通信作者：王 敏，教授，minw@tust.edu.cn.