過表達maspin對人乳腺癌MCF-7細胞凋亡的影響

李艷琦，張同存，孫雪光，廖興華，王 楠，羅學剛

(天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

過表達maspin對人乳腺癌MCF-7細胞凋亡的影響

李艷琦，張同存，孫雪光，廖興華，王 楠，羅學剛

(天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

通過構建maspin表達質粒，在人乳腺癌MCF-7細胞中過表達maspin，研究maspin對MCF-7細胞增殖率及凋亡率的影響．MTT檢測實驗表明，過表達maspin能夠劑量依賴性抑制MCF-7細胞的增殖率．采用TUNEL法和流式細胞術檢測maspin對MCF-7細胞凋亡的影響，結果表明過表達maspin可促進MCF-7細胞凋亡進而抑制其增殖．

乳腺癌；MCF-7細胞；maspin；凋亡

乳腺癌是具有高發率和死亡率的惡性腫瘤之一[1]．乳腺癌的發生和發展是多基因突變的結果，這包括原癌基因的激活和抑癌基因的失活[2]．maspin是一種新型的非經典絲氨酸蛋白酶抑制劑，作為一個腫瘤抑制基因，它能在體內抑制腫瘤的生長和遷移[3–4]．maspin已經被證明能夠抑制細胞運動性、侵襲和遷移[5–6]．然而，maspin對細胞增殖和凋亡的影響還沒有被研究清楚．本文構建了maspin的表達質粒，探索過表達maspin對MCF-7細胞增殖和凋亡的影響，這將為maspin在乳腺癌治療方面的應用提供理論基礎．

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM低糖培養基，Gibico公司；胎牛血清，天津康源生物技術有限公司；空載質粒pcDNA3.1，本實驗室保藏；Fast Pfu DNA聚合酶、質粒抽提試劑盒，北京全式金生物技術有限公司；KpnⅠ限制性內切酶、XhoⅠ限制性內切酶、T4 DNA連接酶、DeadEndTM熒光測定TUNEL系統，Promega生物技術有限公司；M-MLV逆轉錄酶、Turbo轉染試劑、Trizol裂解液，上海英駿生物技術有限公司；膠回收試劑盒、DM2000 Plus DNA Marker，北京康為世紀生物科技有限公司；maspin一抗，Abcam公司；MTT，北京索萊寶科技有限公司；Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒，天津三箭生物技術有限公司．

1.2 細胞株和細胞培養

人乳腺癌細胞株MCF-7細胞為本實驗室保藏．在含體積分數10%滅活胎牛血清的DMEM低糖

培養液中，于37,℃、CO2體積分數5%條件下培養．用體積分數0.25%的胰酶進行消化傳代．

1.3 質粒構建

收集培養的人乳腺癌細胞株MCF-7細胞，提取總RNA后按M-MLV逆轉錄酶說明書逆轉錄成cDNA．以此cDNA為模板，以NCBI上提供的maspin mRNA序列(NM_002639.4)設計包含maspin基因全長和Kpn/ⅠXhoⅠ雙酶位點的引物，上游引物5′-CAGGGGTACCATGGATGCCCT-3′，下游引物5′-GCCACTCGAGTTAAGGAGAACAGAATT-3′，PCR擴增出產物長度為1,148,bp的maspin基因．

將目的基因正向插入到pcDNA3.1載體的KpnⅠ和XhoⅠ克隆位點，構建表達質粒maspin/pcDNA3.1，并經內切酶和測序證實．

1.4 質粒轉染和RT-PCR檢測maspin mRNA水平的表達

用TurbofectTM細胞轉染試劑將4,μg表達質粒maspin/pcDNA3.1按質粒與轉染試劑(μg∶μL)1∶2的比例轉染到MCF-7細胞中．對照組為未處理組和轉染空白質粒組．將細胞以2×105個/孔接種于6孔板中培養12,h后，將質粒–脂質體復合物轉染至細胞中，在無血清的培養液中培養6,h后換新鮮含血清培養液，繼續培養18,h．而后分別收集正常培養、轉染空質粒和轉染表達質粒細胞，提取總RNA后逆轉錄成cDNA．以此為模板進行PCR反應．maspin上游引物5′-AGTGGGTGCTAAAGGTGA-3′，下游引物5′-GAGCCGCTTGATTAGTTT-3′，擴增產物大小148,bp．內參GAPDH由英駿生物技術有限公司合成，上游引物5′-ATTCAACGGCACAGTCAAGG-3′，下游引物5′-GCAGAAGGGGCGGAGATGA-3′，產物大小213,bp，擴增產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色．用BioRad圖像分析儀成像并進行半定量分析，以測定目的基因的表達水平．

1.5 Western blot檢測maspin蛋白水平的表達

分別收集正常培養、轉染空質粒和表達質粒48,h后細胞提取總蛋白，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣本．將蛋白樣本轉移至NC膜上．牛奶封閉液37,℃封閉NC膜1,h，maspin一抗(兔抗，1∶1,000)4,℃孵育過夜．棄一抗，用PBS洗膜3次，加入紅外(700或800,nm)熒光染料標記的二抗(山羊抗兔，1∶5,000)，避光平穩搖動，室溫1.5,h．棄二抗，用PBS洗膜3次，利用oddysey遠紅外成像系統(LICOR公司)掃膜．

1.6 MTT法檢測細胞增殖率

取對數生長期的MCF-7細胞，調整濃度為104,mL-1，接種于96孔培養板中，每孔100,μL．培養12,h后棄去培養基，對照組轉染pcDNA3.1，實驗組梯度轉染maspin/pcDNA3.1(0.05、0.15、0.20,μg)，每組設5個平行孔．在無血清的培養液中培養6,h后換新鮮含血清培養液，繼續培養18,h．用PBS洗2次，每孔加入質量濃度為5,mg/mL的MTT 20,μL和無血清培養液80,μL．繼續培養4,h后棄去上清液，每孔加入DMSO 100,μL，振蕩使紫色結晶物充分溶解.在酶標儀上測定波長490,nm處各孔的吸光度A，并按式(1)計算細胞增殖率．

1.7 TUNEL法檢測細胞凋亡情況

取MCF-7細胞接種于24孔培養板中，培養12,h后分別轉染pcDNA3.1、maspin/pcDNA3.1，質粒質量為1,μg，質粒與轉染試劑比例(μg∶μL)為1∶2，24,h后吸去培養基，用PBS洗滌3次．加入4%多聚甲醛溶液，4,℃放置25,min．加入PBS，放置5,min，重復2次．加入體積分數0.25%的Triton X-100溶液，放置20,min．加入PBS，室溫放置5,min，重復2次．吸干孔板中液體，用100,μL平衡緩沖液覆蓋細胞，室溫放置10,min．吸掉大部分平衡緩沖液，加入50,μL rTdT孵育緩沖液，37,℃避光放置1,h．將300,μL 2×SSC加入孔板，室溫放置15,min．加入PBS，放置5,min，重復2次．加入300,μL DAPI溶液，室溫放置15,min．加入PBS，室溫放置5,min，重復2次．立即在共聚焦顯微鏡(OLYMPUSG公司)下觀察細胞的凋亡情況．

1.8 流式細胞術檢測細胞凋亡情況

分別轉染pcDNA3.1、maspin/pcDNA3.1，質粒質量為8,μg，質粒與轉染試劑比例(μg∶μL)為1∶2，而后分別收集正常細胞，轉染pcDNA3.1的細胞、轉染maspin/pcDNA3.1的細胞，800,g離心10,min，棄上清液．冰PBS洗細胞1次．用1,mL Binding Buffer懸浮細胞，300,g離心10,min，棄上清液．用1,mL Binding Buffer重懸細胞，調整細胞濃度為1×106mL-1，取100,μL細胞懸液加入5,μL Annexin VFITC，輕輕振蕩混勻，室溫避光孵育10,min，再加入5,μL PI，室溫避光孵育5,min，補加400,μL Binding Buffer，輕輕振蕩混勻，1,h內進行流式細胞定量分析，檢測細胞凋亡情況．

2 結果與分析

2.1 maspin/pcDNA3.1表達質粒的鑒定

以提取的cDNA為模板克隆maspin基因片段，將純化后的PCR產物雙酶切后連接到表達載體pcDNA3.1上，構建出表達質粒maspin/pcDNA3.1(圖1)．表達質粒maspin/pcDNA3.1經KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切后得到載體片段和maspin基因片段，初步證明maspin基因被插入到空載質粒中(圖2)．測序鑒定結果表明maspin已成功連接到載體pcDNA3.1上，無突變，與NCBI相應序列一致．

2.2 maspin/pcDNA3.1轉染MCF-7細胞后maspin mRNA表達變化

為了檢測轉染后maspin是否得到了表達，采用了半定量RT-PCR檢測maspin mRNA表達情況，結果如圖3所示．由圖3可知：未轉染組和轉染空載質粒組maspin mRNA無表達；而maspin/pcDNA3.1轉染組與前二者比較maspin mRNA表達明顯增強．這說明轉染maspin/pcDNA3.1表達質粒后maspin能在mRNA水平進行過表達，且轉入空載質粒不影響maspin在mRNA水平的表達．

2.3 maspin/pcDNA3.1轉染MCF-7細胞后maspin蛋白表達變化

為了檢測轉染后maspin是否得到了表達，采用了半定量RT-PCR檢測maspin蛋白表達情況，結果如圖4所示．由圖4可知：未轉染組和轉染空載質粒組maspin蛋白無表達；而maspin/pcDNA3.1轉染組與前二者比較maspin蛋白表達明顯增強．這說明轉染maspin/pcDNA3.1表達質粒后maspin能在蛋白水平進行過表達，且轉入空載質粒不影響maspin在蛋白水平的表達．

2.4 轉染maspin對MCF-7細胞增殖的影響

利用MTT法檢測轉染空載質粒pcDNA3.1和梯度轉染maspin/pcDNA3.1表達質粒后MCF-7細胞的增殖能力，結果見表1．由表1可知：細胞表達maspin蛋白后增殖能力明顯降低，且抑制效應呈現劑量依賴性變化．提示過表達maspin能抑制MCF-7細胞的增殖．

2.5 TUNEL檢測轉染maspin后MCF-7細胞的凋亡

MCF-7細胞分別經空載質粒pcDNA3.1和表達質粒maspin/pcDNA3.1轉染24,h后，利用TUNEL觀察細胞凋亡率的改變．隨機選取10個視野進行觀察并經統計軟件計算凋亡率．TUNEL檢測細胞凋亡

情況如圖5所示．由圖5可知DAPI所染的為細胞核，右側染料所染為凋亡細胞．與轉染空載質粒組相比，轉染表達質粒組細胞凋亡數量升高了約9倍．

2.6 流式細胞術檢測轉染maspin后MCF-7細胞的凋亡

應用AnnexinV-FITC/PI雙標記流式細胞術檢測細胞凋亡，橫坐標是Annexin-V FITC，縱坐標是PI，正常活細胞分布在流式細胞分析圖的左下區，早期凋亡細胞分布在流式細胞分析圖的右下區，晚期凋亡或壞死細胞分布在流式細胞分析圖的右上區，壞死細胞分布在流式細胞分析圖的左上區，圖6結果顯示轉染重組質粒組與轉染空載質粒組MCF-7細胞早期凋亡、晚期凋亡或壞死率均明顯增加．

3 討 論

maspin作為絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族的一個非抑制劑成員，在多種癌癥類型中發揮抑癌作用[7]. maspin的抗腫瘤影響是抑制腫瘤細胞的侵襲，增強對細胞外基質的粘附，增強對凋亡的敏感性，抑制新生血管的形成[5–6]．然而，關于maspin在影響MCF-7細胞的增殖與凋亡的研究目前比較少．

maspin能夠在正常的乳腺或前列腺上皮細胞中表達，然而其在腫瘤細胞中表達減少或喪失[8]．maspin基因在乳腺癌細胞中的表達缺失不是因為maspin基因的缺失或重排[9]，這表明在乳腺癌發展過程中可能有轉錄水平的因素來調節maspin的表達．

凋亡是一種主要的細胞自我消亡過程，它被認為是一種阻止乳腺癌細胞發展的有效途徑．作為抗腫瘤藥物的凋亡誘導物已經引起了廣泛關注，其中的一些已經被應用于臨床[10]．它可能是腫瘤治療中一種非常有前景的治療途徑．先前的報道[6]已經證明maspin在功能上可能與乳腺癌細胞的凋亡有關，能夠使乳腺癌細胞對十字孢堿引起的細胞凋亡更為敏感．而且，5–雜氮脫氧胞苷(5-aza-dc)和曲古柳菌素(TSA)能引起細胞凋亡，并且在這個過程中伴隨的maspin的重新表達也可能與凋亡有關[11]．maspin作為一種新型的E2F1調節基因，表明它可能參與E2F1引起的細胞凋亡，尤其是E2F1和化學藥劑共同引起的凋亡[12]．先前的一些報道[5]還闡明maspin能引起Bax和P21的表達來調節乳腺癌細胞的凋亡．本文也證明了過表達maspin能夠誘導MCF-7細胞的凋亡，從而可以劑量依賴性地抑制MCF-7細胞的增殖．以上結果提示maspin對腫瘤的調節方式是多樣化的，并可能與腫瘤的類別有密切關系．

本實驗研究表明maspin能抑制MCF-7細胞的增殖并引起其凋亡，所以maspin可能在乳腺癌細胞凋亡中起重要作用，并有希望成為一種以凋亡為基礎的乳腺癌治療的改良藥劑，但其具體機制還應進一步研究．

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責任編輯：周建軍

Effect of Overexpressing Maspin on the Apoptosis of Human Breast Cancer Cell MCF-7

LI Yanqi，ZHANG Tongcun，SUN Xueguang，LIAO Xinghua，WANG Nan，LUO Xuegang
(College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

By constructing maspin expression plasmid，the effects of overexpressed maspin on the proliferation and apoptosis of human breast cancer cell MCF-7 were studied. The proliferation of MCF-7 cells was observed with MTT. The results show that the overexpression of maspin inhibited MCF-7 cell’s proliferation in a dose dependent manner. The apoptosis of MCF-7 cells was observed with TUNEL and flow cytometry. The results indicate that the maspin overexprssion could promote the apoptosis of MCF-7 cell and thereby inhibit cellular proliferation.

breast cancer；MCF-7 cells；maspin；apoptosis

R737.9

A

1672-6510(2014)05-0020-04

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.05.005

2013–12–05；

2014–03–12

國家自然科學基金資助項目(31071126，31000343)

李艷琦（1989—），男，天津人，碩士研究生；通信作者：張同存，教授，tony@tust.edu.cn.