半胱亞磺酸脫羧酶在Ishikawa細胞中的表達與檢測

范晶晶， 鄭秋闿

(1. 山東省高校生物化學與分子生物學重點實驗室(濰坊學院)， 山東 濰坊 261061；2. 濰坊學院 a. 生物與農業工程學院； b. 化學化工與環境工程學院， 山東 濰坊 261061)

0 引 言

“生物技術大實驗”是生物技術專業重要的一門綜合實驗課程，內容涉及分子生物學、基因工程、微生物發酵、細胞和組織培養等[1]。在多年來的實驗教學過程中發現存在的最大問題：雖然實驗涉及的內容比較全，但各實驗相互獨立，缺乏內在的聯系性；另外受到傳統教學方式的束縛，學生主動參與實驗設計少，創新性少，導致學生學習熱不高，教學效果不理想[2-4]。為適應生物技術迅猛發展的要求，提高實驗教學的效果，將該門實驗進行了改革：調整成為期1周的集中綜合大實驗，教師結合自己主持的課題項目列出實驗題目，由學生自己查找文獻設計實驗方案，以科研論文形式提交實驗報告。改革后的實驗課程設計的思想是兼顧基礎和前沿，把科研中成熟的先進方法和技術充實到教學中，實現了傳統的驗證性實驗向設計性、研究性、綜合性實驗模式的轉變。

本實驗選擇了人子宮內膜癌Ishikawa細胞系為實驗材料，體外易培養，生長速度快，探索半胱亞磺酸脫羧酶(CSD)[5-6]，在子宮癌細胞中是否有表達，有何作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

Trizol RNA提取試劑盒(Invitrogen公司)， M-MLV Reverse Transcriptase試劑盒(Promega公司)，BCA蛋白定量試劑盒(北京普利萊生物公司)，Taq酶、DNA Marker、蛋白Marker(北京天根生化科技有限公司)。引物由上海生工合成。CSD一抗為兔源多克隆抗體，由法國Prof. Tappaz教授(Directeur de Recherche CNRS, INSERM U 433, France)贈送，其余抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司。試劑為國產分析純。

1.2 實驗儀器

倒置顯微鏡(Nikon, 美國)，顯微攝影系統(Olympus，日本)，凝膠成像系統(AlphaImager，美國)，低溫離心機(Eppendorf，德國)，CO2培養箱(Thermo，美國)，垂直電泳槽和蛋白轉印(BioRad, 美國)。

1.3 方 法

1.3.1Ishikawa細胞培養與傳代

用含10%胎牛血清，100U/ml的青霉素及鏈霉素的DMEM培養基中培養，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱內培養Ishikawa細胞。取對數生長期的Ishikawa細胞待用。細胞傳代用PBS洗兩遍，加入1ml 0.25%胰酶-0.53mmol/L EDTA，37℃消化3 min，加入3 mL有血清培養液終止消化，并計數細胞，按1×105/mL接種細胞到培養瓶或培養皿，每周傳代2次。

1.3.2免疫細胞化學檢測CSD在Ishikawa細胞中的表達

培養的Ishikawa細胞用預冷的PBS漂洗2次，4%多聚甲醛固定30 min，3%的H2O2封閉30 min，用10%羊血清濕盒內封閉40 min，添加CSD一抗工作液(1∶1 500)，置于濕盒內4℃孵育過夜。次日取出用生物素標記的羊抗兔的IgG(GAR-B，1∶150)孵育2 h，加稀釋好的辣根過氧化物酶標記的鏈酶親和素(SP-HRP，1∶200)孵育2 h，最后用DAB顯色，蘇木精進行復染，中性樹脂封片，每次滴加抗體前都用PBS漂洗3次。鏡下見胞質為棕黃色者為陽性染色。陰性對照一抗為兔血清，對照組和實驗組處理過程相同，顯微成像系統拍照。

1.3.3RT-PCR檢測CSD在Ishikawa細胞中表達

參照《精編分子生物學實驗指南》中的方法[8]。吸掉細胞培養液，每個60 mm培養皿加入1 mL Trizol試劑，按照RNA提取說明書進行操作，紫外分光光度計測定RNA濃度。用Oligo dT合成cDNA第一條鏈，特異性引物用于PCR。取2 μg RNA樣本，加入Oligo dT(Promega，美國)2 μL，用DEPC水補至10 μL。65℃水浴5 min,冰上驟冷2～5 min后短暫離心，依次加入M-MLV 5×buffer 5 μL，dNTP 4 μL，RNAsin 1 μL，M-MLV 1 μL，加滅菌DEPC水4 μL終體積為25 μL，用槍頭小心混勻，42℃水浴60 min，-20℃保存待用。取3 μL反轉錄產物cDNA加至PCR反應體系中，引物(見表1)各1 μL，10×buffer 5 μL，dNTP 4 μL，Taqase 1 μL，H2O 35 μL，反應總體積為50 μL。PCR反應體系為：10 ×Buffer 5 μL;dNTP 4 μL;Taq DNA聚合酶1 μL;cDNA第一鏈3 μL;上游引物1 μL;下游引物1 μL;ddH2O 35 μL。條件為：94℃，5 min，然后進入35個循環，每個循環包括：94℃變性30 s，52℃退火20 s，72℃延伸30 s。循環后，72℃延伸10 min。PCR產物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色，AlphaImager凝膠成像系統拍照分析。內標基因選擇β-actin，小鼠肝臟組織擴增產物為CSD陽性對照。

表1 RT-PCR基因擴增引物

1.3.4WesternBlot檢測CSD在Ishikawa細胞中的表達

參照《冷泉港蛋白質組學實驗手冊》中的方法[9]。胰酶消化收集Ishikawa細胞，每個60 mm培養皿加入100 μL TEDGM細胞裂解液，勻漿后液氮反復凍融3次，4℃， 13 000 r/min離心5 min，收集上清。蛋白定量按BCA試劑盒說明書操作。將提取到的蛋白按200 μg總蛋白/泳道上樣，進行SDS-PAGE電泳。依據預染蛋白Marker所示范圍切取凝膠。將膠上已分離開的蛋白按電轉印的標準方法轉移到PVDF膜。轉膜后用5%脫脂奶封閉。將一抗CSD和內參GAPDH作1∶5 000和1∶20 000稀釋后分別與膜在4℃條件下孵育過夜。用堿性磷酸酶標記的羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG(1∶5 000)分別與CSD和GAPDH(內參)膜在常溫下育孵2 h后，用5 mL堿性磷酸酶的底物NBT/BCIP進行顯色約10 min，用自來水沖洗終止反應。小鼠肝臟組織為CSD陽性對照。

2 結果與分析

2.1 細胞培養結果

用倒置顯微鏡觀察Ishikawa細胞，培養的細胞形狀不規則，大小不等，核比例大，呈單層貼壁、生長，排列緊密，密度增加時見堆積現象(見圖1)。

圖1 Ishikawa細胞培養結果

2.2 免疫細胞化學檢測結果

免疫細胞化學結果顯示CSD在Ishikawa細胞中有表達，CSD在陽性細胞的細胞漿中表達(圖2(a))，呈棕褐色，但在有些細胞中只有微弱的表達。陰性對照(圖2(b))中，用未免疫的兔血清代替一抗，呈陰性反應。

(a)棕色為陽性表達;蘭色為細胞核復染結果(b)對照PBS代替一抗免疫染色

圖2 CSD在Ishikawa細胞的免疫細胞化學檢測結果

2.3 PCR擴增結果

RT-PCR電泳結果(見圖3)顯示，從Ishikawa細胞中獲得的CSD PCR產物和預期擴增產物大小一致，約279bp，與肝臟中擴增片段大小一樣。從這個結果可以得出，Ishikawa細胞和肝臟一樣都有CSD mRNA表達，但表達量低于肝臟中。

1-DNA Marker, 2-Ishikawa細胞CSD擴增產物，3-肝臟擴增產物(陽性對照)圖3 PCR電泳檢測結果

2.4 Western Blot檢測結果

Western Blot結果顯示，Ishikawa細胞和肝臟(陽性對照)中檢測到了CSD蛋白，都得到了預期的大小為53 kDa的蛋白條帶(見圖4)，但表達量肝臟高于Ishikawa細胞。

圖4 Western Blot 分析CSD蛋白在Ishikawa細胞中的表達

3 結 語

生物技術是21世紀最具發展前景和活力的學科之一[10]，《國家中長期科學和技術發展規劃綱要(2006—2020年)》將其列為需要大力發展的前沿技術[11]，在《“十二五”生物技術發展規劃》中，也將生物技術產業提到了戰略性新興產業的歷史新高度[12]。在生物技術呈現迅猛發展，新理論、新技術層出不窮的背景下，實驗教學培養出的人才質量越發重要。

生物技術大實驗經過改革，將原有由不同課程間“孤立式”單一的驗證性實驗教學方法轉換為“鏈接式”綜合實驗的新模式[13]。在實驗內容上涉及細胞工程、免疫細胞化學、SDS-Page、Western Blot、RNA提取、RT-RCR等，是學生3年所學的基礎和專業知識綜合應用的檢驗。這種實驗教學模式很好的培養了他們的創新意識、團隊協作精神和嚴謹的科學態度[13-15]。

本實驗涉及CSD基因在Ishikawa細胞中的表達與檢測，在實驗過程中學生還發現很多值得研究的內容，如：CSD基因在Ishikawa細胞表達量不一致，在癌細胞與正常細胞中的表達量差異分析，酶活性差異分析等。所以，本實驗還有很多的研究空間。學生可以根據自身的學習興趣和專業發展需求，繼續設計不同的后續實驗方案，并在此過程中逐步培養其科學探究精神。

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