黃芪注射液對SD大鼠心肌缺血再灌注損傷中Smad3、Smad7表達(dá)的影響

馬速佳，周志強△，李祥波，劉優(yōu)優(yōu)

（1.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院血管外科，河南鄭州450014；2.鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河南鄭州450001）

心血管疾病在當(dāng)今世界，嚴(yán)重威脅著人類的健康，其發(fā)病率和病死率均超過惡性腫瘤而躍居各病之首。全國每年死于心血管疾病300萬人，且發(fā)病年齡呈現(xiàn)日益年輕化的趨勢［1］。目前，心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）已成為影響缺血再灌注心肌從再灌注策略中獲得最佳治療效果的重要因素［2］。相關(guān)臨床試驗表明心肌細(xì)胞的凋亡是 MIRI的一種重要表現(xiàn)［3－4］。目前，對疾病的探討已深入分子學(xué)水平。因此，在分子學(xué)水平上積極探索IRI的發(fā)病機制，具有重大意義。中國醫(yī)學(xué)認(rèn)為：黃芪有益氣固表、斂汗固脫、托瘡生肌、利水消腫之功效［5］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明：黃芪具有強心作用，使心臟收縮振幅增大，輸出量增加，對中毒或疲勞衰竭心臟的作用更為明顯［6］。但具體的機制尚不清楚。本實驗旨在觀察黃芪注射液對 MIRI時Smad3、Smad7表達(dá)的影響，從分子學(xué)水平探討對心肌的保護(hù)作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物及試劑 黃芪注射液［正大青春寶藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z33020179（10mL），黃芪（每10mL相當(dāng)于黃芪20 g）。批號：1205172］，辛伐他汀片（湖北舒邦藥業(yè)有限公司，批號：20120903，規(guī)格20mg）。凱基Annexin V-EGFP細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，KGA-101＿TY7454、Smad3、Smad7兔抗大鼠多克隆抗體購自美國Sauita公司，RT-PCR試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。引物由北京博大泰克公司合成。Smad3正向引物：5′-ATG TCA TCT ACT GCC GCT TGT-3′，反向引物：5′-GTC GCT AGT TTC TCC ATC TTC AC-3′。擴(kuò)增片段為327bp。Smad7正向引物：5′-TGG TGC GTG GTG GCA TAC TGG-3′，反向引物：5′-GAC TCT TGT TGT CCG AAT TGA GCT-3′，擴(kuò)增片段為142bp 。β-actin 作為內(nèi)參照，正向引物：5′-CCC ATC TAT GAG GGT TAC-3′，反向引物：5′-GGA AGG TGG ACA GTG AG-3′，擴(kuò)增片段為568bp。

1.1.2 實驗動物及分組 健康雄性SPF級成年SD大鼠32只，體質(zhì)量（230±20）g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，分為假手術(shù)組（生理鹽水2mL每天2次，共6d，腹腔注射），缺血再灌注組（生理鹽水2mL每天2次，共6d，腹腔注射），辛伐他汀組（20mg·kg－1·d－1），黃芪注射液組（生藥每支2mL，4g，每天2次，共6d，腹腔注射）。分組后分別按要求給予藥物干預(yù)，共7d，第8天分別按各組要求對動物進(jìn)行處理。

1.1.3 主要儀器 DW-2000型動物人工呼吸機（上海嘉鵬科技有限公司），PCR擴(kuò)增儀（Eppendorf公司）。D-140圖像記錄分析系統(tǒng)（鄭州卓鑫電泳儀器有限公司 ）。

1.2 方法

1.2.1 建立動物模型 采用結(jié)扎大鼠心臟左冠狀動脈前降支的方法［7］制作MIRI模型。假手術(shù)組不予結(jié)扎，所有實驗組結(jié)扎40min后松開結(jié)扎線，再灌注120min。

1.2.2 凋亡心肌細(xì)胞的檢測 取再灌注120min后左冠狀動脈前降支所支配區(qū)域的心肌組織4mm3，制備單細(xì)胞懸液（機械法），收集上清液。加入2mL冷的PBS洗滌細(xì)胞2次。重置細(xì)胞于500μL Binding Buffer，分別加入10μL Annexin VEGFP和10μL碘化并啶（PI），混勻。在室溫暗處反應(yīng)15 min，上流式細(xì)胞儀，檢測自動計算凋亡心肌細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比。

1.2.3 免疫組織化學(xué)法檢測SD大鼠心肌細(xì)胞Smad3與Smad7蛋白表達(dá) 在取檢測凋亡的心肌細(xì)胞的同一部位組織的同時，另取心肌組織約4mm3，迅速用10%的中性福爾馬林溶液固定，以5μm厚度制作石蠟切片，常規(guī)脫蠟水化。采用免疫組織化學(xué)SP法進(jìn)行染色，具體步驟按SP試劑盒說明書操作。在光鏡下觀察，以心肌細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。在高倍鏡下觀察，每張切片任意選取5個視野（×400），分析并計數(shù)陽性表達(dá)細(xì)胞占整個視野的百分比，并取平均值來表示被測蛋白的表達(dá)量。

1.2.4 SD大鼠心肌細(xì)胞Smad3與Smad7mRNA表達(dá)的檢測 取相同部位的大鼠心肌組織50mg，勻漿后用Trizol試劑盒提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄過程按照試劑盒說明書操作。用BECKMAN640紫外分光光度計檢測RNA水平：A（A260／280）值1.6～2.0為合格，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物與緩沖液混合后加入瓊脂糖凝膠的加樣孔中，進(jìn)行電泳。在紫外線投射儀下觀察電泳條帶，用D-140圖像記錄分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，以Smad3或Smad7的DNA條帶與對應(yīng)β-actin條帶的灰度比值表示該因子mRNA的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，4組SD大鼠心肌細(xì)胞的凋亡情況，Smad3蛋白、Smad7蛋白及Smad3 mRNA、Smad7mRNA的表達(dá)的比較分別采用單因素方差分析，LSD-t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 用Annexinv-EGFP試劑盒檢測的4組心肌細(xì)胞的凋亡情況 見表1。

表1 各組SD大鼠心肌細(xì)胞的凋亡情況（±s，n＝8）

表1 各組SD大鼠心肌細(xì)胞的凋亡情況（±s，n＝8）

a：P＜0.05，與假手術(shù)組比較；b：P＜0.05，與缺血再灌注組比較。－：此項無數(shù)據(jù)。

組別 劑量（g／kg） 凋亡率（%）假手術(shù)組6.460±0.145 0缺血再灌注組 － 15.356±0.292 1a辛伐他丁組 0.02 13.003±0.312 2b黃芪注射液組 16.00（相當(dāng)于生藥量） 12.978±0.327 2－b

2.2 SD大鼠心肌組織中Smad3、Smad7蛋白的表達(dá) SD大鼠心肌組織中Smad3、Smad7蛋白的表達(dá)情況見表2。在假手術(shù)組心肌細(xì)胞中表達(dá)有大量的Smad7蛋白，少量的Smad3蛋白。與假手術(shù)組相比，可以發(fā)現(xiàn)缺血再灌注組Smad3蛋白表達(dá)量明顯增加（P＜0.05），Smad7蛋白的表達(dá)則明顯降低（P＜0.05）；與缺血再灌注組相比，辛伐他丁組（P＜0.05）和黃芪注射液組（P＜0.05）Smad3蛋白表達(dá)均明顯降低，但兩組Smad7蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.05），而辛伐他汀組和黃芪注射液組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組SD大鼠心肌細(xì)胞Smad3及Smad7蛋白的表達(dá)情況

圖1 Smad3mRNA的表達(dá)

表3 各組SD大鼠心肌細(xì)胞Smad3、Smad7 mRNA的表達(dá)比較

2.3 SD大鼠心肌組織中Smad3、Smad7mRNA的表達(dá)情況 見表3，圖1、2。

圖2 Smad7mRNA的表達(dá)

3 討 論

組織缺血再灌注損傷是指缺血再灌注后，由于中性粒細(xì)胞活化，活性氧產(chǎn)生等因素所導(dǎo)致的炎癥產(chǎn)生、細(xì)胞凋亡、以及結(jié)構(gòu)損傷的病理過程［7－8］。近年來的臨床和實驗表明，心肌細(xì)胞的凋亡是引起MIRI重要的發(fā)病機制［9］。在心肌細(xì)胞的缺血再灌注過程中可以產(chǎn)生大量的氧自由基，進(jìn)而可能通過下列途徑，損傷正常的心肌細(xì)胞［10］：作用于心肌細(xì)胞的細(xì)胞膜，從而引發(fā)脂質(zhì)過氧化，影響細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的功能；直接作用于心肌細(xì)胞的DNA，誘發(fā)其凋亡；作用于核基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，改變心肌細(xì)胞的表型特征誘發(fā)凋亡；攻擊心肌細(xì)胞里面的蛋白質(zhì)，使具有酶活性的蛋白質(zhì)活性喪失或減弱［11］。從傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)角度講，由于冠狀動脈的供血不足引起心肌細(xì)胞缺血、缺氧導(dǎo)致心肌失養(yǎng)，造成不同程度的心氣虧虛。而再灌注之后，因心氣虧虛、運血無力，使得血行淤阻，血流不暢。因此，氣虛血淤是心肌缺血再灌注過程中重要的病理變化。

近些年來，國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)Smad有如下3類［12］：受體特異型Smads，也就是由Ⅰ型受體所激活的Smad蛋白包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8；共同介質(zhì)型 Smads，包括：Smad4；抑制型Smads，包括：Smad6、Smad7。Smad是轉(zhuǎn)化生長因子－β（TGF-β）胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要組成部分，它可以將TGF－β信號直接由細(xì)胞膜通過TβRⅠ、TβRⅡ受體結(jié)合形成的復(fù)合物，使其自身被磷酸化，并通過誘導(dǎo)結(jié)合形成的復(fù)合物轉(zhuǎn)運至細(xì)胞核內(nèi)。TGF超家族中包括TGF-β家族和BMP家族，二者均是Smad蛋白經(jīng)典的激活因子。TGF-β在心肌細(xì)胞中的主要作用通過活化Smad3蛋白，來誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡［13］。蘇麗婷等［14］研究發(fā)現(xiàn)Smad7蛋白有抑制 TGF－β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，Smad7屬于抑制型Smad，可以通過干擾Smad磷酸化［15］，影響TGF－β超家族信號通路的傳導(dǎo)。Smad7屬此通路的負(fù)反饋環(huán)路。即Smad3與Smad7之間存在相互拮抗的作用，共同調(diào)節(jié)著心肌細(xì)胞的凋亡。

本研究采用結(jié)扎左冠狀動脈前降支的方法制備SD大鼠心肌缺血再灌注模型，模擬急性冠脈綜合征后的溶栓過程，用黃芪注射液預(yù)處理，來探討黃芪注射液對MIRI的保護(hù)作用，并且與辛伐他丁的抗再灌注損傷效果相比較。結(jié)果顯示：MIRI后Smad3蛋白及Smad3mRNA的表達(dá)明顯升高，同時細(xì)胞的凋亡也增加，但是Smad7蛋白及mRNA表達(dá)是降低的。黃芪注射液組和辛伐他丁組Smad3蛋白及Smad3mRNA的表達(dá)明顯下降，心肌細(xì)胞的凋亡減少。Smad7蛋白及Smad7 mRNA的表達(dá)量是顯著升高的，與缺血再灌注組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。綜上所述：Smad3蛋白、Smad7蛋白參與了MIRI過程中的凋亡信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。并且，二者之間存在相互影響。黃芪注射液可以抑制Smad3蛋白及Smad3mR-NA的表達(dá)，促進(jìn)Smad7蛋白和Smad7mRNA的表達(dá)，來影響MIRI的心肌細(xì)胞的凋亡，這種影響可能對于慢性缺血性心肌病的治療以及心臟外科，血管外科術(shù)中減少損傷，維持正常的心臟功能有著深遠(yuǎn)的意義，為臨床治療開辟了新思路。

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