KAI1蛋白對786-O細胞增殖及凋亡的影響＊

陳 峰，魯 偉，竇紅珍，游 剛，付云銳，謝 鑫

（重慶市南川區人民醫院泌尿外科 408400）

腎透明細胞癌（clear cell renal cell carcinoma，CCRCC）是腎小管上皮細胞發生一系列的鏈鎖基因突變或功能損傷所造成的瘤變過程［1］。CCRCC是腎癌中最為常見的病理學亞型，大約占腎癌的60%～85%［2］。因此，CCRCC的致病機制的研究對人類抗腎癌有著重要的作用。

有研究表明［3］，趨化因子受體CXCR-4是一種缺氧性反應分子，抑癌基因VHL可以對CXCR-4進行反向調節，使其表達降低，當VHL抑癌基因失活時可使腫瘤通過依賴乏氧誘導因子（HIF）依賴性CXCR-4發生轉移，因此，CXCR-4的表達關系到CCRCC的侵潤、轉移。近年來，研究證實KAI1也是一種腫瘤轉移抑制基因，在腫瘤的轉移、增殖方面有明顯的作用［4］。KAI1最早在前列腺癌細胞中被發現，因此，被稱為前列腺癌轉移抑制基因［5］。當KAI1的正常功能被破壞或喪失時，可導致腫瘤細胞的黏附力、侵襲性、移動性及分化程度受到影響。目前，研究已證實，KAI1在非小細胞肺癌、結直腸癌、鼻咽癌、胃癌等多種腫瘤細胞的轉移、增殖及侵襲過程中發揮重要作用［6－8］。但是，KAI1在腎透明細胞癌的侵襲、增殖及轉移中是否發揮作用，尚未有研究進行證實。本研究擬通過慢病毒轉染KAI1基因到腎癌細胞株中，觀察其對人腎透明細胞癌786-O的增殖、轉移、侵襲及凋亡的影響，為本研究后續的研究奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 腎透明細胞癌786-O細胞株購自中國醫學科學院基礎醫學研究所。大腸埃希菌DH5α購自北京奧科生物技術有限公司，pCMV慢病毒載體購自上海北諾生物科技有限公司。兔抗人KAI1抗體及羊抗兔辣根過氧化物酶二抗均購自美國Santa Cruz公司。噻唑藍（MTT）、二甲亞砜（DMSO）購自上海Sigma公司，RPMI-1640培養基購自 Hycolone公司。胎牛血清購自杭州四季青公司。Annexin V／FITC凋亡試劑盒購自南京凱基生物公司。本實驗分為3組：轉染KAI1基因的作為實驗組（pCMV-KAI1）、轉染pCMV空載體的為陰性對照組（pCMV-NEG）、未進行處理的786-O細胞為空白對照組（CON）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將786-O細胞接種于細胞培養瓶中，用含有20%胎牛血清的RPMI1640培養液培養，37℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養。每2～3d傳代一次，細胞消化使用胰酶，之后進行培養，并取對數生長期的786-O細胞進行培養。

1.2.2 慢病毒感染及感染率的檢測 慢病毒載體感染786－O細胞，具體過程參見文獻［9］，786-O細胞接種于24孔板，待細胞生長至約80%融合時，分別加入不同效價的pCMV-KAI1，培養6h后棄上清液，換含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液繼續培養48h，熒光顯微鏡下觀察細胞轉染情況，計算感染率。感染率（%）＝熒光細胞數／全部細胞數×100%。

1.2.3 MTT實驗 將對數生長期的786-O細胞數量調整為大約1×105／細胞培養瓶，并將其接種于96孔細胞培養板，每孔的接種量為100μL，在細胞培養箱中培養24h后，分別轉染pCMV-KAI1載體及pCMV空載體，空白對照組使用同體積的PBS溶液。繼續靜止培養24h，加入10mg／mL的MTT試劑，培養3h后加入DMSO，在酶標儀540nm波長出檢測每一孔的吸光度值A。

786-O細胞抑制率＝（1-實驗組孔平均A值）／空白對照組空A值×100%。

1.2.4 流式細胞儀檢測 將對數生長期的786-O細胞接種于六孔板中，保證每孔細胞數大約為2×104／孔，培養24h后加入pCMV-KAI1表達載體，繼續培養24h后用胰酶進行消化，并收集786-O細胞。根據Annexin V／FITC凋亡檢測試劑盒的使用說明書進行細胞凋亡的檢測。

1.3 統計學處理 采用SPSS17.0軟件進行數據分析處理，計量資料±s進行表示。采用單因素方差分析進行組間比較，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 慢病毒轉染效率測定 慢病毒載體感染細胞48h，由于pCMV攜帶有GFP標簽，所以，在熒光顯微鏡下觀察慢病毒載體轉染效率。慢病毒載體轉染的量為MOI-10，實驗組可見大量的熒光表達，而空白對照組中未見熒光表達，見圖1。

圖1 倒置熒光顯微鏡觀察慢病毒轉染786-O細胞的轉染效率（熒光顯微鏡×400）

2.2KAI1的表達對786-O細胞增殖活性的影響 實驗組轉染pCMV-KAI1載體后，通過MTT法檢測出實驗組分別與陰性對照組和空白對照組比較，786-O細胞的增值能力顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.05），其細胞存活率為39.43%，見圖2。

2.3KAI1促發786-O細胞凋亡的發生 由于 MTT結果證實KAI1高表達使786-O細胞的增殖活性降低，作者推測活性的降低可能是由于KAI1誘發了細胞凋亡的發生，因此，流式細胞技術（FCM）檢測細胞凋亡情況。結果顯示，KAI1的表達顯著的增加了786-O細胞凋亡的數量，與陰性對照組和空白對照組相比差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3。

圖2 KAI1對786-O細胞增殖活性的影響

圖3 流式細胞技術檢測KAI1對786-O細胞凋亡的影響

3 討 論

CCRCC是最為常見的泌尿系統惡性腫瘤，成人腎癌的發病中有大約三分之二為CCRCC，其5年平均生存率一般不足20%［10］，同時隨著人們生活水平的不斷提高，其發病率也在不斷升高。CCRCC不同于一般腫瘤，在臨床上應用放療及化療的方法治療效果較差，因此，大多的CCRCC患者最終都必須進行手術切除。但是，存在的問題是CCRCC的發病比較隱蔽，癥狀表現不明顯，在確診時可能已經是腫瘤晚期，發生了大量增殖、擴散，一般預后不佳［11］。盡管CCRCC轉移率較高、容易擴散，但其發生發展的分子機制目前尚未十分明確，因此，發現CCRCC增殖及轉移的分子機制對于CCRCC的控制及尋找其轉移的早期分子標記具有十分重要的意義。

研究顯示，KAI1能夠抑制腫瘤的增殖及轉移，在分離的腫瘤細胞中，KAI1蛋白水平顯著降低。這說明KAI1與腫瘤細胞的增殖間進行著激烈的博弈，此消彼長。本研究中，作者首次嘗試探討KAI1蛋白在CCRCC 786-O細胞增殖及細胞凋亡中的作用。

慢病毒載體是以慢病毒的基因組結構框架為模版，將病毒復制及致病的有關基因敲除，并將某些分子標記物及治療性基因插入，從而組建而成為慢病毒基因治療工具。慢病毒載體具有轉染效率高、在細胞及動物體內維持時間長的特點，同時能夠感染多種哺乳動物細胞［12］。本研究選擇慢病毒載體p-CMV，其帶有綠色熒光標簽，可以標記KAI1從而檢測其在786-O細胞中的表達效率。GFP綠色熒光顯示，在實驗組細胞中有80%左右的細胞呈現出了GFP表達陽性，證明KAI1在786-O細胞中的表達效率較高。

MTT結果顯示，786-O細胞轉染了pCMV-KAI1載體后，786-O細胞的活性顯著降低（P＜0.01），這說明CCRCC癌細胞786-O的增殖受到KAI1表達的影響，這與Shi等［13］報道的結果相似。Uchida等［14］應用免疫組織化學法對食管癌和正常食管中KAI1表達進行研究，顯示食管癌組織中KAI1的表達顯著降低，這也證實KAI1的表達可以保證正常食管不發生瘤變。由于786-O增殖活性降低，本研究推測可能是由于786-O細胞發生了細胞凋亡。因此，本研究應用FCM檢測了KAI1表達后786-O細胞的凋亡情況，結果證實KAI1表達細胞與陰性對照組和空白對照組相比，早期凋亡數和晚期凋亡數都顯著降低，說明KAI1對786-O細胞增殖的抑制作用可能是通過啟動細胞凋亡而實現的。Li等［15］也證實，KAI1在非小細胞肺癌中的表達可誘導細胞凋亡的發生，并且抑制了細胞增殖。因此，KAI1蛋白在786-O細胞中的表達，可促進腫瘤細胞的凋亡，從而抑制腫瘤細胞的增殖。因此，術后KAI1蛋白的常規檢查可能對診斷和判斷預后有一定的價值。對其致病機制的進一步研究，可以為CCRCC的治療提供新的靶點。

［1］ Hahn WC，Weinberg RA.Rules for making human tumor cells［J］.N Engl J Med，2002，347（20）：1593-1603.

［2］ Gigante M，Li G，Ferlay C，et al.Prognostic value of serum CA9in patients with metastatic clear cell renal cell carcinoma under targeted therapy［J］.Anticancer Res，2012，32（12）：5447-5451.

［3］ Staller P，Sulitkova J，Lisztwan J，et al.Chemokine receptor CXCR4downregulated by von Hippel-Lindau tumour suppressor pVHL［J］.Nature，2003，425（6955）：307-311.

［4］Jiang WX，Song BG，Wang PJ.Expression of nm23，KAI1 and spiral computed tomography findings in primary gallbladder carcinoma［J］.Chin Med J（Engl），2009，122（21）：2666-2668.

［5］ Dong JT，Lamb PW，Rinker-Schaeffer CW，et al.KAI1，a metastasis suppressor gene for prostate Cancer on human chromosome 11p11.2［J］.Science，1995，268（5212）：884-886.

［6］ 呂錚，閻繼東，張志勇，等.KAI1和Smad4在非小細胞肺癌的表達及臨床病理意義［J］.重慶醫科大學學報，2012，37（11）：968-971.

［7］ Malik FA，Sanders AJ，Jones AD，et al.Transcriptional and translational modulation of KAI1expression in ductal carcinoma of the breast and the prognostic significance［J］.Int J Mol Med，2009，23（2）：273-278.

［8］ 季潤元，趙玉芳，束曉明，等.胃癌組織 KAI1／CD82、MRP1／CD9的表達及臨床意義［J］.江蘇醫藥，2012，38（14）：1640-1642.

［9］ Ghosh SS，Gopinath P，Ramesh AA，et al.Denoviral vect ors：aprom isi ng t ool for gene t herapy［J］.Appl Biochem Biotechnol，2006，133（1）：9-30.

［10］Li JW，Shen Y，Zhang YG.Experiment research of curcumin on the proliferation and apoptosis of human renal cell carcinoma cell line 786-O［J］.中 國 醫 藥 導 報，2012，9（11）：19-21.

［11］Seligson D，Janzen N，Yu H，et al.Using tumor markers to predict the survival of patients with metastatic renal cell carcinoma［J］.J Urol，2005，173（5）：1496-1501.

［12］Nishitsuji H，Ikeda T，Miyoshi H，et al.Expression of small hairpin RNA by lentivirus-based vector confers efficient and stable gene-suppression of HIV-1on human cells including primary non-dividing cells［J］.Microbes Infect，2004，6（1）：76-85.

［13］Shi H，Deng JH，Zheng SB，et al.Lentivirus mediated clusterin silence inhibits proliferation and promotes apoptosis in human renal cell Cancer line 786-O in vitro［J］.Mol Med Rep，2012，8（1）：35-40.

［14］Uchida S，Shimada Y，Watanabe G，et al.Motility-related protein （MRP-1／CD9）and KAI1／CD82expression inversely correlate with lymph node metastasis in oesophageal squamous cell carcinoma［J］.Br J Cancer，1999，79（7／8）：1168-1173.

［15］Li C，Wang ZY，Wang P，et al.Expression of metastasis suppressor gene KAI1in non-small cell lung Cancer and its significance［J］.Chinese Journal of General Practice，2010，8（1）：15-17.