ESAT-6上調TLR-4通路增強人外周血γδT細胞產生淋巴因子的實驗研究＊

代光明，汪 洪，鄭 權，杜先智

（1.四川省遂寧市第一人民醫院呼吸內科，四川遂寧629000；2.重慶醫科大學附屬第二醫院呼吸內科，重慶400010）

近年來大量研究顯示，γδT細胞在機體抗結核免疫中起重要作用，除可以直接殺死結核桿菌外，還可通過分泌多種淋巴因子直接或間接參與抗結核的免疫應答，以及促進巨噬細胞等其他免疫細胞的抗結核免疫反應［1］，γδT細胞產生淋巴因子受多種刺激因素的影響。結核分枝桿菌早期分泌靶抗原（early secreted antigenic target-6，ESAT-6）是由結核分枝桿菌在早期感染階段產生的分泌蛋白，具有極強的特異性，存在于致病性結核分枝桿菌中，ESAT-6具有T細胞抗原決定簇，有較強的免疫原性及免疫反應性，有極強的抗原特異性，能激活γδT細胞的功能［2－3］。為了研究ESAT-6對γδT細胞IL-17、腫瘤壞死因子－α（TNF-α）、干擾素－γ（IFN-γ）淋巴因子表達的影響，本研究采用ESAT-6刺激γδT細胞，并通過探討Toll樣受體－4（TLR-4）通路對 ESAT-6刺激γδT 細胞IL-17、TNF-α、IFN-γ的表達的影響，從細胞內信號的角度更深入的解析ESAT-6刺激γδT細胞產生淋巴因子的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 ESAT-6抗原、TLR-4受體特異性抑制劑E5564購自美國Sigma公司，Trizol RNA提取試劑盒、Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA Marker DL1000等 PCR 試劑及 TLR-4引物購自大連寶生物Takara公司，蛋白免疫印跡法（Western blot）配膠試劑盒購自碧云天生物技術研究所，蛋白裂解液購自南京凱基生物科技發展有限公司，淋巴細胞分離液購自中國醫學科學院生物工程研究所，IL-2購自Peprotech公司，異硫氰酸熒光素（FITC）標記的抗人γδT TCR受抗、FITC標記的鼠抗IgG1K同性空白對照受體購自美國eBioscience公司，TNF-α、IFN-γ、IL-17酶聯免疫吸附實驗（ELISA）試劑盒購自美國Sig－ma公司，TLR-4抗體購自美國Abcam公司，β-actin內參購自北京四正柏生物有限公司，RPMI1640干粉、胎牛血清購自美國Gibco公司，流式細胞儀（FCM）購自美國Beckman Coulter公司。

1.2 方法

1.2.1 外周血單個核細胞的制備 抽取健康志愿者血液40 mL（肝素抗凝），與Hank′s液40mL混勻后，取消毒滅菌的50 mL離心管2只，加入20mL淋巴細胞分離液，將混勻的血液緩慢加入淋巴細胞分離液上面，注意保持分界面清晰。以2 000r／min離心15min，吸取第二層環狀乳白色淋巴細胞層，將吸取細胞加入5mL無血清RPMI1640培養基中，以800 r／min，離心洗滌10min，然后加入5mL磷酸鹽緩沖液（PBS），以800r／min離心洗滌，每次10min，所得白色細胞沉淀即為外周血單個核細胞，將所得的單個核淋巴細胞轉入6孔板中，加入2mL含有10%胎牛血清、100U／mL雙抗的RPMI1640培養液，放置于5%、37℃恒溫培養箱中培養。

1.2.2 γδT細胞分離純化及培養 將所得的PBMC培養3d后，用 PBS調整細胞濃度至1×108／mL，加入 Anti-human gamma delta TCR-FITC熒光抗體，以 Mouse IgG1KIsotype Control FITC熒光抗體為同型陰性對照，在37℃、5%CO2恒溫培養箱中孵育1h，用FCM分離純化γδT細胞，并用RPMI1640完全培養基調整細胞濃度至1×105／mL，備用。

1.2.3 實驗分組 將分離純化的γδT細胞培養于6孔板中，每孔中加入1mL培養液，分為不加任何刺激因子的空白對照組、ESAT-6（10μg／mL）處理組、E5564（10μmol／mL）處理組、ESAT-6（10μg／mL）＋E5564（10μmol／mL）處理組，實驗藥物濃度參考文獻［4］，每次設置3個復孔，重復3次。用RPMI1640完全培養基調整每孔的培養液至每孔2mL，并在每孔中加入IL-2（200U／mL）及唑來膦酸（300pg／mL）刺激培養γδT細胞，將細胞置于37℃、5%CO2恒溫培養箱中，每2天換1次液，并繼續用同等濃度的刺激因子刺激培養，分別在第1、3、6、9、12天用 ELISA法檢測上清培養液中 TNF-α、IFN-γ、IL-17的含量，并在第12天后用逆轉錄-PCR（RT-PCR）法檢測TLR-4基因轉錄水平，用Western blot法檢測各實驗組TLR－4蛋白的表達變化。

1.2.4 ELISA 法檢測 TNF-α、IFN-γ、IL-17的含量 加入各刺激因子后，分別在第1、3、6、9、12天使用ELISA法檢測各實驗組上清液中 TNF－α、IFN-γ、IL-17的含量。取需要檢測的實驗組培養液及各濃度標準液100μL包被96孔酶標板，空白對照組加入100μL蒸餾水，在各孔中加入50μL的酶標記溶液（不含空白對照孔），37℃孵育反應1h，然后加入顯色劑A、B液各100μL，25℃下避光反應15min，再加入50μL的終止液終止顯色，并于酶標儀450nm處測量各孔的吸光度值，根據標準曲線查找出相應濃度，并計算出實際的 TFN－α、IFN-γ、IL-17濃度值。

1.2.5 RT-PCR檢測 TLR-4基因轉錄 將各處理組的 γδT細胞用Trizol法提取總RNA，參照Takara逆轉錄說明書獲得cDNA，以兩步法進行RT-PCR擴增，按照PCR說明書配制反應液。設置94℃預變性5min；94℃變性30s、58℃退火（內參59℃退火）30s、72℃延伸30s（內參延伸50s），35個循環（內參30個循環）；72℃延伸5min，即得PCR擴增產物，以3%的瓊脂糖電泳，用凝膠成像儀掃描成像。PCR引物如下，TLR-4正向引物：5′-ATC TCA GCA AAA TCC CTC AT-3′，反向引物：5′-AAT CCA GCA AAA TCC CTC AT-3′，β-actin正向引物：5′-CTG GGA CGA CAT GGA GAA A-3′，反向引物：5′-AAG GAA GGC TGG AAG AGT GC-3′。

1.2.6 Western blot檢測TLR-4蛋白 將需要檢測處理的γδT細胞提取總蛋白后，用BCA法檢測蛋白濃度，加入上樣緩沖液，用蛋白裂解液調整各實驗組蛋白濃度至5μg／μL，并在沸水中加熱10min。配制8%的分離膠及濃縮膠，每孔加入40μg蛋白樣品，然后電泳、切膠，并用PVDF膜轉膜，用PBST配制的5%脫脂奶粉封閉1h，再用5%脫脂奶粉按照1∶1 000（β-actin內參1∶3 000）稀釋兔抗人 TLR-4一抗4℃過夜封閉，次日用PBST洗膜3次，每次10min，用5%脫脂奶粉按照1∶5 000稀釋加辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗，室溫孵育1h，再用PBST洗膜3次，每次10min，然后用ECL作為發光試劑顯影成像并拍照。

1.3 統計學處理 采用SPSS18.0軟件進行統計分析，計量資料以±s表示，樣本均數的兩兩比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 PCR檢測γδT細胞TLR-4mRNA的轉錄 經加入不同的刺激因子處理γδT細胞，12d后用PCR法檢測γδT細胞TLR-4的基因轉錄，PCR結果顯示，ESAT-6組TLR-4的基因轉錄較空白對照組顯著增強（P＜0.01）；E5564處理組TLR-4的基因轉錄水平較空白對照組差異無統計學意義（P＞0.05），與ESAT-6組相比，TLR-4基因轉錄水平顯著下調（P＜0.01）；ESAT-6＋5564組，TLR-4基因的轉錄水平較空白對照組增加，差異有統計學意義（P＜0.05），較ESAT-6組 TLR-4基因的轉錄水平顯著下調，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖1。

圖1 PCR檢測TLR-4蛋白基因的表達

2.2 Western blot檢測γδT細胞TLR-4蛋白表達 經不同處理后，各組γδT細胞培養12d后，用 Western blot法檢測γδT細胞TLR-4蛋白的變化，ESAT-6組TLR-4蛋白的表達較其余各組明顯增強（P＜0.01）；ESAT-6＋E5564組 TLR-4蛋白的表達較空白對照組增強，差異有統計學意義（P＜0.05）；E5564組較空白對照組TLR-4蛋白的表達差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 Western blot檢測TLR-4蛋白的表達

2.3 各實驗組淋巴因子 TNF－α、IFN-γ、IL-17的檢測 各實驗組經不同的處理培養后，分別在第0、1、3、6、9、12天用ELISA 法檢測各組培養液中 TNF－α、IFN-γ、IL-17的含量。

2.3.1 TNF-α的濃度檢測 ELISA 結果顯示，ESAT-6組TNF-α的含量在前6d隨著培養時間呈上升趨勢，且各時間點較其余各組顯著增加（P＜0.01），但在培養第6天后TNF-α的表達呈下降趨勢；ESAT-6＋E5564組 TNF-α含量較 ESAT-6組顯著下降（P＜0.01），但是仍較空白對照組增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；在第9天后TNF－α的表達上升不明顯（P＞0.05），見圖3。

圖3 TNF－α在不同時間點的含量變化

2.3.2 IFN-γ的表達檢測 ELISA 結果顯示，ESAT-6組IFN-γ在各時間點的含量較其余各組顯著增強（P＜0.01），ESAT-6＋E5564組IFN－γ表達較 ESAT-6組顯著下降（P＜0.01），較空白對照組增加，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖4。

圖4 IFN-γ在不同時間點的含量變化

2.3.3 IL-17的濃度的檢 測 ELISA 結果顯示，ESAT-6組IL-17各時間點的表達較其余各組顯著增強（P＜0.01），ESAT-6＋E5564組IL-17表達較 ESAT-6組顯著下降（P＜0.01），較空白對照組增加，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖5。

圖5 IL-17在不同時間點的含量表達

3 討 論

γδT細胞是CD4＋、CD8＋雙陰性細胞，其抗原的處理和提呈不受組織相容性復合體限制，作用介于固有免疫和適應性免疫之間［5］，在機體抗結核、抗感染、自身免疫性疾病以及抗腫瘤中發揮著重要的作用。ESAT-6是由結核分枝桿菌在早期感染階段產生的分泌蛋白，具有極強的特異性，存在于致病性結核分枝桿菌中，不存在于卡介苗及非致病性結核桿菌中，ESAT-6具有T細胞抗原決定簇，與培養濾液蛋白10（culture filtrate protein 10，CFP-10）在體內以1∶1二聚體的形式發揮作用［2，6－7］，有極強的免疫原性及抗原特異性，能特異性的激活γδT細胞的功能。

IL-17、IFN-γ、TNF-α具有多種生物學效應，與機體防御、自身免疫性疾病、腫瘤有著密切的聯系，在保持細胞免疫及免疫記憶中具有重要作用。IL-17不僅在機體病變部位將中性粒細胞誘導至炎癥部位而發揮生物學效應［8－9］，還能促進中性粒細胞增殖及分泌炎癥因子；本實驗通過ESAT-6刺激γδT細胞，可發現ESAT-6能顯著提高γδT細胞IL-17的表達，這也從一方面解釋了結核患者血液中IL-17較正常人明顯增高的原因［4，10］，而在用結核分枝桿菌感染小鼠的模型中，γδT 細胞是產生IL-17的主要細胞，并不是 CD4＋T 淋巴細胞［11］。IFN-γ能顯著活化巨噬細胞，增強巨噬細胞對結核桿菌的抑制及殺傷作用［12］，γδT細胞屬于在感染早期提供IFN-γ來源的免疫細胞［13］，本研究顯示γδT細胞經ESAT-6刺激后能迅速產生大量的IFN－γ。在結核病的發病過程中，TNF-α在誘導炎癥細胞因子的保護性免疫反應中發揮重要作用，對機體的抗感染起到一定的保護作用；本研究在實驗早期觀察到ESAT-6能刺激γδT細胞迅速產生TNF－α，同時也觀察到TNF－α在第9天后TNF－α的含量呈下降趨勢，可能的原因是TNF－α達到一定的濃度時，γδT細胞可通過分泌其他的負性免疫調節因子控制免疫水平，避免機體對結核等產生過激的免疫反應。

TLR-4是介導內毒素及脂多糖的重要受體，主要表達于單核細胞、巨噬細胞、淋巴細胞等細胞表面，能識別結核分枝桿菌的相關成分，激活免疫系統，導致炎癥介質的釋放［14－15］。本研究使用ESAT-6刺激γδT細胞后，γδT細胞 TLR-4在基因轉錄及蛋白表達上顯著上調，同時也觀察到細胞培養液中TNF-α、IFN-γ、IL-17的含量也顯著增加；而 E5564＋ESAT－6組盡管 TNF－α、IFN-γ、IL-17在上清液中的含量較 ESAT-6組明顯下降，但是仍然較空白對照組及只加入TLR-4特異性抑制劑 E5564組 TNF－α、IFN-γ、IL-17的含量增加，差異有統計學意義，這也提示ESAT-6刺激γδT細胞產生 TNF－α、IFN-γ、IL-17與TLR-4信號通路密切相關，并且可推測ESAT-6還可以通過其他的途徑刺激γδT細胞產生 TNF-α、IFN-γ、IL-17。

本研究結果顯示，ESAT-6能誘導γδT細胞產生大量的TNF-α、IFN-γ、IL-17等淋巴因子，可能與 TLR-4信號通路有關，也分析了炎癥反應與信號通路及免疫細胞之間的相互關系，不僅從一方面解釋了結核患者早期血清中TNF－α、IFN-γ、IL-17含量明顯增高的原因，也為外周藥物誘導γδT細胞產生保護性的免疫物質提供了一定的理論基礎。

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