強(qiáng)直性脊柱炎中醫(yī)辨證分型與免疫炎癥指標(biāo)的相關(guān)性研究?

張皖東，曹云祥，葛 瑤，萬(wàn) 磊，劉 健，黃傳兵，汪 元，諶 曦，王桂珍，范海霞

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕科，合肥 230031)

強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一種主要侵犯中軸關(guān)節(jié)、以骶髂關(guān)節(jié)炎和脊柱強(qiáng)直為主要特點(diǎn)的風(fēng)濕性疾病，其發(fā)病可能與遺傳、感染、免疫、環(huán)境等因素有密切關(guān)系。中醫(yī)藥治療AS大多采用辨病辨證相結(jié)合的方法，雖然各位醫(yī)家的辨證分型均有不同，但在臨床上皆取得較好的療效[1,2]。盡管如此，如能將現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的微觀實(shí)驗(yàn)室診斷與中醫(yī)宏觀辨證結(jié)合起來(lái)，將對(duì)全面認(rèn)識(shí)疾病的本質(zhì)、提高防治效果具有重要意義。

本課題前期對(duì)AS患者的證候?qū)W調(diào)查表明，本病以腎氣不足、脾胃虧虛為本，寒濕、濕熱為標(biāo)，瘀血貫穿疾病的始終[3，4]。臨床上將本病主要分為濕熱證、督寒證、瘀血證3個(gè)證型，取得了較好療效。免疫炎癥在AS 的發(fā)病過(guò)程中具有相當(dāng)重要的作用，ESR、hs-CRP等與AS的病情活動(dòng)程度具有相關(guān)性，而針對(duì)TNF-α的治療也在臨床上取得滿意療效。為此，課題組就這些指標(biāo)與AS中醫(yī)辨證分型之間的相關(guān)性研究報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕科2012 年2 月至2013 年12月門(mén)診及住院的116例AS 患者，其中男性 89 例，女性 27 例，男女比例約 3.30∶1。

1.2 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)

參照強(qiáng)直性脊柱炎1984 年紐約標(biāo)準(zhǔn)和2009年ASAS推薦的中軸型SpA的分類標(biāo)準(zhǔn)[5,6]。

1.3 中醫(yī)證候診斷標(biāo)準(zhǔn)

參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則(試行)》[7]制定辨證標(biāo)準(zhǔn)。①濕熱證主癥：腰骶脊背疼痛、腰背活動(dòng)受限、晨僵、目赤腫痛、發(fā)熱或外周關(guān)節(jié)紅腫熱痛，次癥：口渴或口干不欲飲、肢體困重、大便干或溲黃，舌紅、苔黃或黃厚膩、脈滑數(shù)。②督寒證主癥：腰骶脊背疼痛、腰背活動(dòng)受限、晨僵、畏寒喜暖、得熱則舒、四末不溫，次癥：外周關(guān)節(jié)冷痛、肢體困重、小便清長(zhǎng)或夜尿頻多、舌淡、苔白或水滑、脈弦滑。③瘀血證主癥：腰骶脊背疼痛、腰背活動(dòng)受限、晨僵、疼痛夜甚、刺痛，次癥：肌膚干燥少澤、舌暗或有瘀斑、脈沉細(xì)或澀。凡具備：①符合4項(xiàng)主癥加上1項(xiàng)次癥或舌脈；②符合5項(xiàng)主癥，該證型診斷成立。

1.4 觀測(cè)項(xiàng)目及方法

1.4.1 一般項(xiàng)目 性別、年齡、病程等。

1.4.2 主要癥狀和體征 患者總體VAS評(píng)分、患者腰背痛VAS評(píng)分、BASDAI 評(píng)分、BASFI功能評(píng)分、ASDAS評(píng)分等。ASDAS=0.121×腰背痛VAS評(píng)分+0.058×晨僵持續(xù)時(shí)間+0.110×患者總體評(píng)價(jià)+0.073×外周關(guān)節(jié)疼痛/腫脹+0.579×(CRP+1)的自然對(duì)數(shù)[8]。

1.4.3 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo) ESR檢測(cè)采用魏氏法，hs-CRP、 IgA、IgG、IgM使用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)，TNF-α采用ELISA方法檢測(cè)。

1.4.4 Treg 的檢測(cè) 抽取受試者新鮮靜脈血3 mL，取100 μL先后加入10 μL 小鼠抗人CD4-FITC、5 μL 小鼠抗人CD25-PC5和10 μL 小鼠抗人 CD127-PE(Beckman-Coulter 公司，美國(guó))，振蕩搖勻，避光靜置20 min后加入紅細(xì)胞裂解液，振蕩搖勻，避光15 min，PBS洗滌2次，離心5 min (1500 r/min)棄上清，每份標(biāo)本加入0.1%多聚甲醛500 μL，用流式細(xì)胞儀(Beckman-Coulter XL-ESPICMCL 型，美國(guó))檢測(cè)外周血CD4+CD25+CD127-Treg的表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各證型患者的年齡和病程情況

表1顯示，AS患者中督寒證患者的平均病程最長(zhǎng)，瘀血證患者次之，濕熱證患者相對(duì)較短，濕熱證患者與督寒證患者的病程比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；督寒證患者的平均年齡最大，瘀血證患者次之，濕熱證患者相對(duì)較小，濕熱證患者與督寒證患者的平均年齡比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表1 AS各證型患者病程與年齡情況

注：與督寒證比較：**P<0.01

2.2 各證型患者的各量表評(píng)分

表2顯示，各證型AS患者的總體VAS評(píng)分、背痛VAS評(píng)分、BASFI以及BASDAS之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，濕熱證患者的ASDAS評(píng)分顯著高于督寒證和血瘀證患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表2 AS各證型患者的各量表評(píng)分

注：與督寒證比較：*P<0.05，**P<0.01；與血瘀證比較：ΔΔP<0.01

2.3 各證型患者的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)

表3顯示，濕熱證患者的ESR、hs-CRP水平顯著高于督寒證和血瘀證患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。各證型AS患者IgG、IgA和IgM水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。濕熱證患者的TNF-α 水平顯著高于督寒證和血瘀證患者(P<0.01)。濕熱證患者的CD4+CD25+Treg 表達(dá)頻率顯著高于督寒證患者(P<0.01)(圖1為各證候AS患者CD4+CD25+CD127-Treg表達(dá))。

表3 AS各證型患者的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)

注：與督寒證比較：*P<0.05，**P<0.01；與血瘀證比較：ΔP<0.05，ΔΔP<0.01

圖1 各種證型AS患者CD4+CD25+CD127-Treg表達(dá)A:濕熱證,B:督寒證,C:血瘀證

2.4 疾病活動(dòng)度比較

表4顯示，根據(jù)ASDAS 分界值，ASAS工作組通過(guò)了評(píng)價(jià)病情活動(dòng)度的4 種狀態(tài)[9]：病情無(wú)活動(dòng)：ASDAS 評(píng)分<1.3；中等活動(dòng)：ASDAS評(píng)分 1.3～2.1；高度活動(dòng)：ASDAS 評(píng)分>2.1～3.5；極高度活動(dòng)：ASDAS 評(píng)分>3.5，各證候患者的疾病活動(dòng)分布情況。經(jīng)Kruskal-Wallis Test，χ2值為18.404 (P=0.000)，各證候患者的疾病活動(dòng)情況不完全相同。再將各證型和疾病活動(dòng)度做四表格卡方檢驗(yàn)，兩兩比較可知，濕熱證AS患者極高度活動(dòng)性顯著高于督寒證和血瘀證患者(P<0.01)，無(wú)活動(dòng)、中等、高度活動(dòng)度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，督寒證和血瘀證AS患者各疾病活動(dòng)性比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表4 AS各證型患者的疾病活動(dòng)情況

注：與督寒證比較：**P<0.01；與血瘀證比較：ΔΔP<0.01

3 討論

根據(jù)臨床表現(xiàn)，AS屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”、“腰痛”范疇；中醫(yī)病名文獻(xiàn)描述較多，有“大僂”、“骨痹”、“腎痹”、“龜背風(fēng)”、“竹節(jié)風(fēng)”、“尪痹”、“背傴”、“白虎歷節(jié)”等。關(guān)于本病的病因病機(jī)，歷代醫(yī)家認(rèn)為不出內(nèi)外兩端，腎虛督空是內(nèi)在基礎(chǔ)，外邪是發(fā)病條件，腎虛邪痹是最基本的病理變化，氣血瘀阻貫穿病程始終。根據(jù)前期的研究結(jié)果，結(jié)合臨床實(shí)際情況，我們將前來(lái)就診的AS患者分為濕熱證、督寒證和血瘀證3個(gè)證型。

本研究表明，AS 患者中腎虛督寒證較腎虛濕熱證的年齡大、病程長(zhǎng)。年輕人陽(yáng)氣偏盛，雖有脾腎虧虛但正氣尚存，邪氣入侵后易從陽(yáng)化熱出現(xiàn)濕熱之象。年長(zhǎng)者陽(yáng)氣漸衰，腎陽(yáng)虧虛則溫煦、氣化失司，脾虛則濕盛，故臨床多見(jiàn)畏寒喜暖、得熱則舒、四末不溫、肢體困重、小便清長(zhǎng)或夜尿頻多等癥。疾病初起，人體正氣相對(duì)較盛，正邪交爭(zhēng)，故多見(jiàn)發(fā)熱、外周關(guān)節(jié)紅腫熱痛；病程日久，正氣漸傷，腎精虧耗，陽(yáng)氣更加失于輸布，虛寒之象更加明顯。

目前應(yīng)用最廣泛的評(píng)價(jià)AS疾病活動(dòng)性的指標(biāo)是Bath AS疾病活動(dòng)指數(shù)(bath ankylosing spondylitis disease activity index，BASDAI)[10]。BASDAI包括以下6項(xiàng)內(nèi)容：①過(guò)去1周你感受的疲勞/困倦的總體程度？②過(guò)去1周你感受到的頸痛、背痛和髖痛的總體程度？③過(guò)去1周你感受到的其他關(guān)節(jié)疼痛/腫脹(不包括頸痛、背痛和髖痛)？④過(guò)去1周你感受到的由于觸痛或壓痛導(dǎo)致不適的總體程度？⑤過(guò)去1周在醒后你感受到晨僵的總體程度？⑥晨僵持續(xù)時(shí)間。每個(gè)項(xiàng)目得分為患者自我評(píng)價(jià)的VAS(0～10)評(píng)分。BASDAI=0.2[第1項(xiàng)+第2項(xiàng)+第3項(xiàng)+第4項(xiàng)+0.5(第5項(xiàng)+第6項(xiàng))]。

Bath AS功能指數(shù)[11](Bath AS functional index．BASFI)反映的是AS患者的軀體功能，主要包括以下10方面內(nèi)容：①穿襪子或貼身衣服；②彎腰拾物；③從較高處取物；④從沒(méi)有扶手的椅子上站起來(lái)；⑤從仰躺著的地板上站起來(lái)；⑥站立10 min；⑦登10～15級(jí)臺(tái)階；⑧向后看；⑨完成體力活動(dòng)；⑩完成1 d的家務(wù)和工作。要求患者根據(jù)晚上上述活動(dòng)時(shí)的難易程度在VAS標(biāo)尺上標(biāo)出分?jǐn)?shù)：0分表示最好，10分表示最差，最后計(jì)算平均分。國(guó)內(nèi)外許多研究表明，BASFI是影響活動(dòng)性AS患者生活質(zhì)量較為重要的臨床指標(biāo)。但由于BASDAI和BASFI都是通過(guò)患者的主觀評(píng)價(jià)加以評(píng)分，并不包含任何客觀指標(biāo)，在臨床實(shí)踐中略有缺陷。

2009年，國(guó)際脊柱關(guān)節(jié)炎評(píng)價(jià)工作組(ASAS)提出了新的AS疾病活動(dòng)性評(píng)價(jià)指數(shù)ASDAS，并已在多個(gè)國(guó)家人群中應(yīng)用，提示在辨別疾病活動(dòng)性高低及活動(dòng)性前后變化程度方面，ASDAS指數(shù)均優(yōu)于BASDAI[12，13]。ASDAS是第1個(gè)綜合患者主觀評(píng)價(jià)及ESR、CRP病情活動(dòng)的評(píng)分系統(tǒng)，共有4種計(jì)算方法[14]。黃烽[15]研究表明，ASDAS、BASDAl與醫(yī)生和患者的總體評(píng)價(jià)有較好的相關(guān)性，而ASDAS的相關(guān)性優(yōu)于BASDAI，其中以ASDAS-CRP的相關(guān)性最好，故我們采用ASDAS-CRP的計(jì)算方法。

研究表明，AS患者各中醫(yī)證型之間患者總體VAS評(píng)分、患者背痛VAS評(píng)分以及BASFI比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明前來(lái)就診的AS患者大都存在明顯的疼痛和功能受限。濕熱證AS患者BASDAI、ASDAS顯著高于督寒證和血瘀證患者，且濕熱證患者血清ESR、hs-CRP水平顯著高于督寒證和血瘀證患者，說(shuō)明濕熱證的疾病活動(dòng)度相對(duì)督寒證和血瘀證為高，ESR、hs-CRP不僅可以反映疾病的活動(dòng)程度，且提示ESR、hs-CRP可能作為AS濕熱證候分類的微觀指標(biāo)。

既往研究表明，AS 患者外周血中CD4+CD25+Treg表達(dá)頻率顯著低于健康人群，提示CD4+CD25+Treg表達(dá)頻率的降低在AS 發(fā)病中可能起到重要作用[16]。CD4+CD25+Treg是一種具有免疫調(diào)節(jié)功能的 T 細(xì)胞亞群，對(duì)效應(yīng)性 T 細(xì)胞具有抑制作用,抑制炎癥反應(yīng)，并能直接抑制 B 淋巴細(xì)胞的活化和分化,降低 IgG、IgA[17]。

CD4+CD25+Treg 表面有多種表型，但大多不具有特異性，CD4+CD25+Treg 活化后也可表達(dá)。CD127是鑒別Treg較為特異的表面分子，相關(guān)研究表明[18，19]，CD127表達(dá)與FoxP3呈負(fù)相關(guān)，能抑制人類CD4+CD25+Treg功能，因此CD4+CD25+CD127low/-Treg被認(rèn)為是具有高度抑制活性、高表達(dá)FoxP3的Treg。

本研究表明，督寒證AS患者的外周血中CD4+CD25+CD127low/-Treg表達(dá)較瘀血證和濕熱證患者顯著降低，但其IgG、IgA、IgM水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明AS患者體液免疫均處于較高水平，各中醫(yī)證型之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，雖然各證型體液免疫狀態(tài)之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但其上游因素可能并不完全相同，督寒證可能與CD4+CD25+CD127low/-Treg表達(dá)頻率降低更為密切。

TNF-α具有介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)作用，在AS 的發(fā)病及骨代謝中起重要作用[20，21]。近年來(lái)，以TNF-α為靶點(diǎn)的多種生物制劑在AS的臨床治療中取得了很好的療效。本項(xiàng)研究表明，濕熱證AS患者外周血清中TNF-α水平顯著高于督寒證和血瘀證患者，說(shuō)明TNF-α可能與AS中醫(yī)證型之間存在一定的聯(lián)系。

綜上所述，濕熱證AS患者的ESR、hs-CRP、TNF-α水平均顯著高于血瘀證和督寒證AS患者，督寒證AS患者的CD4+CD25+CD127low/-Treg水平均顯著低于血瘀證和濕熱證AS患者，ESR、hs-CRP、TNF-α、CD4+CD25+CD127low/-Treg水平不僅反映AS患者的病情活動(dòng)程度和免疫功能狀態(tài)，而且與其中醫(yī)證型間存在著一定聯(lián)系，可能作為 AS患者中醫(yī)辨證的微觀指標(biāo)。

[1] 張皖東，盛長(zhǎng)健，曹云祥，等．強(qiáng)直性脊柱炎中醫(yī)藥研究進(jìn)展[J]．中醫(yī)藥臨床雜志，2011,23(5)：464-467．

[2] 張鴻升，周賓賓．強(qiáng)直性脊柱炎的中醫(yī)治療進(jìn)展[J]．中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2013，41(4)：135-137．

[3] 汪四海，劉健，張金山．從脾論治強(qiáng)直性脊柱炎骨代謝失衡理論探討[J]．中華中醫(yī)藥雜志，2013,28(8)：2233-2235．

[4] 汪四海，劉健，楊佳，等．102例強(qiáng)直性脊柱炎患者中醫(yī)證候回顧性研究[J]．中醫(yī)藥臨床雜志，2011，23(6)：522-524．

[5] 張乃崢．臨床風(fēng)濕病學(xué)[M] ．上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1999：165.

[6] Rudwaleit M, van der Heijde D, Landewé R, et al. The developmentof assessment of spondyloarthritis international society classification criteria for axial spondyloarthritis(part Ⅱ)：validation and final selection[J]. Ann Rheum Dis,2009,68(6)：777-783.

[7] 鄭筱萸．中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則(試行)[S] ．北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2002：119-123．

[8] Heijde D, Lie E, Kvien TK. ASDAS, a highly discriminatory ASAS-endorsed disease activity score in patients with ankylosing spondylitis[J]. Ann Rheum Dis,2009,68：1811-1818.

[9] Machado P, Landewé R, Lie E, et al. Ankylosing Spondylitis Disease Activity Score(ASDAS)： defining cut-off values for disease activity states and improvement scores[J]. Ann Rheum Dis,2011,70：47-53.

[10] Garrett S，Jenkinson T，Kennedy LG，et al. A new approach to defining disease status in ankylosing spondylitis：the Bath Ankylosing Spondylitis Disease Activity Index[J]. J Rheumatol，1994，21(12)：2286-2291.

[11] Calin A，Garrett S，Whitelock H，et al．A new approach to defining functional ability in ankylosing spondylitis：the development of the Bath Ankylosing Spondylitis Function Index[J]．J Rheumatol，1994，21(12)：2281-2285．

[12] 趙越,張莉蕓,茹晉麗.強(qiáng)直性脊柱炎療效評(píng)估指標(biāo)的研究進(jìn)展[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2010，14(2)：135-138.

[13] Heijde D, Lie E, Kvien TK. ASDAS, a highly discriminatory ASAS-endorsed disease activity score in patients with ankylosing spondylitis[J]. Ann Rheum Dis,2009,68：1811-1818.

[14] C Lukas, R Landewé, J Sieper, et al．Development of an ASAS-endorsed disease activity score (ASDAS) in patients with ankylosing spondylitis[J]. Ann Rheum Dis， 2009，68:18-24．

[15] 杜旭娜，李晏，張勝利，等. 強(qiáng)直性脊柱炎病情活動(dòng)度評(píng)分對(duì)強(qiáng)直性脊柱炎患者病情活動(dòng)性判斷的價(jià)值[J]. 中華內(nèi)科雜志，2010,51(3)：206-209．

[16] 劉健，汪四海，萬(wàn)磊，等．強(qiáng)直性脊柱炎患者外周血Treg 的變化及中醫(yī)健脾單元療法對(duì)其影響[J]． 中國(guó)臨床保健雜志，2012，15(1) : 1-4．

[17] 郎濤，吳廣勝． CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞與自身免疫性疾病[J]． 醫(yī)學(xué)綜述，2008，14(19) : 2887-2889．

[18] Hartigan O，Connor DJ，Poon C，et al． Human CD4(+ )regulatory T cells express lowers of the IL-7 receptor alpha chain(CD127)，allowing consistent identification andsorting of live cells[J]． Immunol Methods，2007，31(9)：41-52．

[19] 李冬梅，李向培，厲小梅，等． 強(qiáng)直性脊柱炎患者外周血CD4+CD25+CD127low/-T 細(xì)胞檢測(cè)及其意義[J]．中華臨床免疫和變態(tài)反應(yīng)雜志，2008，2(4) : 266-270．

[20] Chatzikyriakidou A, Georgiou I, Voulgari PV, et al. The role of tumor necrosis factor (TNF)-alpha and TNF receptor polymorphisms in susceptibility to ankylosing spondylitis[J]. Clin Exp Rheumatol， 2009，27(4):645-648.

[21] Karkucak M, Capkin E, Alver A, et al. The effect of anti-TNF agent on oxidation status in patients with ankylosing spondylitis[J]. Clin Rheumatol， 2010，29(3):303-307.