通絡救腦注射液及其有效組分對擬缺血損傷腦微 血管內皮細胞BDNF表達的影響?

郭曉謹，周夢佳，李 峰，李芳赫，萬亮琴，張 賽， 馬家寶，李衛紅△，李興廣△

(1．北京中醫藥大學，北京 100029；2. 通州中西醫結合醫院，北京 101100)

近年來研究表明，腦缺血后受損的腦組織可出現神奇的再塑性，神經元發生的機制與血管發生有重要的相關性，所以促進缺血后的血管新生成為腦缺血后治療的新思路[1]。通絡救腦注射液是由梔子苷和三七總皂苷2種組分配伍而成的現代注射劑。前期研究顯示，通絡救腦注射液及其2組分均可有效提高擬缺血損傷內皮細胞活性，減輕缺血內皮細胞的氧化應激損傷，且2組分在發揮抗氧化作用途徑方面各有所側重[2]。本實驗在前期研究基礎上，觀察通絡救腦注射液及其2有效組分對擬缺血損傷腦微血管內皮細胞BDNF的表達影響，從血管再生因子角度闡釋該注射液的藥效及配伍機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

原代的大鼠腦微血管內皮細胞，采用實驗室已建立的方法[3]進行內皮細胞的分離純化和培養。

1.2 擬缺血損傷模型的制備

采用本實驗室已建立的糖氧剝奪模型[4]，細胞傳至第三代，用無糖的Kreb’s液置換原培養基，放入低氧培養箱(氣體含量為94%N2，5%CO2，1%O2)，37℃繼續培養6h。

1.3 實驗分組與處理

培養的腦微血管內皮細胞分成5組，分別為正常組、模型組、梔子苷組、三七總皂苷組、通絡救腦注射液組。除正常組外，其余各組均按上述方法造模。各給藥組分別按梔子苷33.2 μg/ml、三七總皂苷22 μg/ml、通絡救腦注射液55.2 μg/ml的藥物濃度在造模前3 h以及造模過程中給藥，處理結束后進行指標檢測。

1.4 western blotting法檢測各組微血管內皮細胞BDNF的表達

用細胞刮收集各組內皮細胞，在冰上用細胞破碎機破碎，離心后取上清，BCA 法檢測蛋白定量。配制聚丙烯酰胺凝膠，將變性蛋白樣品加入緩沖液，蛋白凝膠電泳，然后轉膜(PVDF膜)，用5%的脫脂奶粉封閉PVDF膜上的蛋白潛在結合位點，分別加入一抗，4℃過夜，加入二抗后ECL試劑顯色、照相。

1.5 免疫熒光法檢測各組微血管內皮細胞BDNF的表達

將各組微血管內皮細胞在4%的多聚甲醛中固定10min，l% TritonX-100透化處理2～3 min，5%BSA封閉1 h后，加入5%BSA稀釋的一抗4℃過夜。5%BSA稀釋的熒光標記的二抗于37℃孵育1 h。用ProLong Gold antirade reagent with DAPI抗淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察并照相。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 western blotting檢測BDNF的表達情況

圖1顯示，與正常組比較，腦微血管內皮細胞擬缺血損傷后BDNF的表達量明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，梔子苷組BDNF的表達有所升高，但組間比較差異無統計學意義(P>0.05)；三七總皂苷組與通絡救腦注射液組BDNF的表達明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖1 western blotting檢測BDNF的結果注：與正常對照組比較:*P<0.05；與模型組比較:# P<0.05

2.2 免疫熒光法檢測的BDNF的表達情況

圖2顯示，熒光顯微鏡下各組細胞BDNF表達均呈陽性，淺色熒光顆粒主要位于胞漿，尤其是核周。正常組細胞胞體較大，淺色熒光相對較弱；模型組細胞回縮明顯，變得細長，細胞間隙變大，熒光強度明顯變強；3個給藥組的熒光強度進一步增強，尤其是三七總皂苷組與通絡救腦注射液組增強明顯，結果與western blotting相一致。

3 討論

血管新生是指在原有血管基礎上通過血管內皮細胞增殖、游走、芽生、血管分裂及分支而形成新的毛細血管網，使其功能與局部需要相適應的生物學過程[5]。腦缺血中后期缺血半暗帶開始出現血管新生，損傷部位新生的側支血管可以改善缺血區周圍的血液供應，血管新生可能為神經元的重構提供了關鍵的神經血管底物。研究表明，腦組織血管密度高的卒中患者預后明顯好于血管密度低的患者，腦血管新生可明顯改善缺血區周圍的組織灌注，彌補因血流量不足導致的腦損傷，縮小腦梗死體積，重塑神經結構，使神經功能盡快盡可能恢復[6]。因此，促進血管新生成為治療腦缺血的一條有效途徑。

圖2 免疫熒光法檢測BDNF的結果注：A.正常組；B.模型組；C.梔子苷組；D.三七總皂苷組；E.通絡救腦注射液組

BDNF是一類多功能的多肽因子，是神經營養因子家族中的一員[7]，它廣泛分布于中樞神經系統，包括海馬、小腦、大腦皮質等。BDNF除在神經系統中起重要作用外，還在維持血管內皮細胞的存活、促進缺血部位內皮細胞的增殖中發揮重要作用，是一種重要的血管再生因子。研究顯示，多發性骨髓瘤細胞患者血漿中BDNF水平明顯升高，可能與參與骨髓瘤細胞誘導血管新生有關[8]。王雅丹等[1]認為，腦源性神經營養因子通過AKT和ERK1/2信號通路誘導內皮細胞血管生成。從本實驗的結果來看，內皮細胞擬缺血損傷后BDNF的表達較正常組明顯升高，提示氧糖剝奪的刺激啟動了內皮細胞的自修復機制，BDNF可能參與內皮細胞的自修復。與模型組比較，梔子苷組BDNF的表達有所升高，但無統計學意義；三七總皂苷與通絡救腦注射液組比較，模型組BDNF的表達明顯升高，差異有統計學意義。結果提示，三七總皂苷與通絡救腦注射液對擬缺血內皮細胞BDNF的表達具有顯著上調作用，這可能是其發揮血管保護和促進血管新生作用的機制之一，但梔子苷在這一環節作用不明顯。

綜上所述，通絡救腦注射液可明顯提高缺血后內皮細胞促血管再生性因子BDNF的表達，這對改善微血管再生環境、促進腦缺血損傷后微血管的新生、從而有效恢復缺血區血液供應具有重要意義，可能是該注射液發揮腦保護的內在機制之一。2有效

組分中三七總皂苷對BDNF的表達有顯著上調作用，而梔子苷在上調BDNF環節作用不明顯，提示2組分在發揮促血管再生方面，三七總皂苷可能作用更為突出。

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