脾氣虛證代謝綜合征大鼠血液代謝組學研究?

楊宇峰，齊艷文，徐 娜，石 巖△

(1.遼寧中醫藥大學，沈陽 110032；2.遼寧電力中心醫院，沈陽 110016)

代謝組學(metabolic syndrome，MS)主要通過系統研究生命體在新陳代謝動態過程中代謝產物的變化規律，從而揭示機體生命活動代謝的本質[1]。代謝組學是中醫證理論研究的重要方法，利用代謝組學發現中醫病證的關鍵生物標記物，可促進“證”本質研究和中醫辨證的科學化和定量化，深層次理解中醫證候的本質[2]。

本課題擬通過復制脾虛證代謝綜合征大鼠模型，對模型血漿標本進行代謝組學檢測，尋找脾虛證代謝綜合征病變的特征性代謝產物，并觀察代謝物與生理病理變化的相對關系，探尋脾虛證代謝綜合征病變的分子機制，從而揭示脾虛證代謝綜合征中醫證候本質。

1 材料

1.1 實驗動物

健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠20只，體質量(180±20)g，由遼寧中醫藥大學教學實驗中心提供(動物合格證號SCXK(遼)2004-0018)。實驗前大鼠適應性喂養1 d，自由飲水，無不良反應、進食、飲水和活動正常者納入實驗。大鼠按隨機數字表法分為空白組和模型組，每組10只。

1.2 材料與試劑

乙腈(HPLC)、甲醇(HPLC)購自MERK公司(USA)，甲酸購自TEDIA公司(USA)，其他試劑均為市售分析純。

1.3 主要儀器設備

超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜聯用儀(美國Waters公司)；超低溫冰箱(MDF-U53V，三洋)；TG16-WS臺式高速離心機(湘儀離心機儀器有限公司)。

2 方法

2.1 造模方法

通過勞倦加飲食不節法造模[3]，同時制定脾氣虛證和代謝綜合征動物模型評估標準[3]，符合標準診斷者為造模成功，成模大鼠6只，成模率為60%。

2.2 樣本采集

2組動物取材前12 h禁食不禁水，按2 ml/kg體質量腹腔注射8%異戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血，分離血清，-80℃保存。

2.3 樣本制備

向100 μL樣本中加入400 μL色譜級甲醇∶乙腈=1∶1，Vortex 2 min后于4℃放置10 min，4℃15000 rpm離心15 min，取上清液400 μL，4℃15000 rpm離心10 min，取200 μl上清液進行LC-MS全譜檢測。

2.4 UPLC/Q-TOF-MS分析

將UPLC/Q-TOF-MS獲得的原始質譜數據導入MarkerLynx 軟件包，進行峰識別、峰對齊和基線矯正等前處理，最后輸出三維矩陣，即由精確質核比與保留時間組成的變量、樣品名稱和峰強度/面積。將處理后的數據矩陣導入Simca-P11.5軟件分別進行主成分分析(PCA)，偏最小二乘方判別分析(PLS-DA)。

3 結果

3.1 原始色譜圖檢測

圖1顯示，對所有質控樣本(quality control,QC)的總離子流色譜圖(total ion current chromatogram，TIC)進行檢查，未發現含有異常TIC的樣本。QC樣本均勻分散在整個實驗過程中，說明系統穩定性良好，數據可靠性良好。

圖1 正離子模式下QC樣品的UPLC Q-TOF MS總離子流(TIC)重現性比較

3.2 主成分分析(PCA)

3.3 偏最小二乘方-判別分析(PLS-DA)

圖2～圖4顯示，在PLS-DA處理下，模型組與空白組得到很好的分離。結果顯示，模型在ESI+模式下，R2X=0.452，R2Y=0.999，Q2=0.857，即其中45.2%的變量被作為用來塑造模型的主要成分，99.9%的樣本符合模型判別，模型的預測能力為85.7%。

圖2 ESI+模式下脾氣虛證代謝綜合征大鼠 血樣代謝PCA分析Scores圖注：PC=2，R2X=0.389，Q2=-0.023 GroupA=空白組；GroupC=模型組

圖3 ESI+模式下脾氣虛證代謝綜合征大鼠 血樣代謝PLS-DA分析Scores圖二維圖注：Scores plot of PLS-DA of group A Vs group C (ESI+) PC number=3，R2X=0.456，R2Y=0.997， Q2=0.835GroupA=空白組；GroupC=模型組

圖4 ESI+模式下脾氣虛證代謝綜合征大鼠 血樣代謝PLS-DA分析loading圖

3.4 尋找差異性代謝物

表1顯示，本實驗采用PLS-DA模型第一主成分的VIP(Variable Importance in the Projection)值(閾值>1)，并結合t檢驗的P值(閾值0.05)來尋找差異性表達代謝物。差異性代謝物的定性方法為，根據精確分子量搜索Metlin和HMDB數據庫，搜索質量閾值設定為25ppm。鑒定出9個生物標志物，9種代謝物在模型組中含量增加，與模型組比較差異有統計學意義。

4 討論

通過實驗研究，找到一些與脾氣虛證代謝綜合征大鼠模型相關的潛在生物標記物，而這些物質正是體內糖類、脂類、蛋白質等代謝紊亂的結果。其中，N-乙酰基-D-葡萄糖胺是葡萄糖在代謝過程中形成6-磷酸果糖經谷氨酰胺6-磷酸果糖酰基轉移酶(GFAT)作用下生成的，這個過程也稱為己糖胺合成通路(HBP)。HBP是機體正常的葡萄糖代謝途徑之一，其流量因細胞外葡萄糖水平過高而增加，被認為是機體的能量感受器，與胰島素抵抗、高血糖、高脂血癥和高胰島素血癥等密切相關[4]。絲氨酸屬于非必需氨基酸，具有許多重要的生理功能和作用。研究發現[5]，高胰島素和高糖誘導胰島素抵抗的分子機制可能與削弱細胞內胰島素信號蛋白絲氨酸磷酸化以及進一步的胰島素信號傳遞，從而抑制糖的轉運活動有關。溶血磷脂酰膽堿能激活蛋白激酶 C，通過 Ca2+依賴或 Ca2+非依賴途徑導致血管平滑肌收縮，同時抑制內皮衍生一氧化氮、血管內皮超極化因子的釋放或使其失活，影響內皮依賴性舒張作用，導致內皮依賴性收縮[6]。還可促進內皮細胞和平滑肌細胞的增殖，損害血管內皮組織的連續性，促進血管炎癥反應并影響血小板聚集及血栓形成的過程。

表1 潛在生物標志物鑒定結果

脾氣虛證代謝綜合征的發生與糖類、脂類、蛋白質代謝紊亂有關，這些體內的小分子內源性代謝物可能是代謝綜合征中醫證候的物質基礎。這些發生改變的代謝物可作為脾虛證代謝綜合征的生物標志物進行進一步的研究。

[1] 潘明,陳瓊.中醫體質、病證研究與代謝組學[J].上海中醫藥雜志,2008,42(6):53-56.

[2] 賈偉,蔣健,劉平,等.代謝組學在中醫藥復雜理論體系研究中的應用[J].中國中藥雜志，2006,31(8):621-624.

[3] 楊宇峰,滕飛,石巖. 脾氣虛證代謝綜合征大鼠模型的復制[J].中國中醫基礎醫學雜志,2013,19(5):163-165.

[4] Buse MG．Hexosamines，insulin resistance，and the complications of diabetes：current status[J].Am J Physiol Endocrinol Metab,2006,290：El-E8．

[5] Carvalho E,Rondinone CM,Smith U.Insulin resistance in fat cells from obese Zucker rats-Evidence for an impaired activation and translocation of protein kinase B and glucose transporter 4[J].Mol Cell Biochem,2000，206:7-16.

[6] Ota Y,Kugiyama K,Sugiyama S,et al.Complexes of apoA-1 with phosphatidylcholine suppress dysregulation of arterial tone by oxidized LDL[J]. Am J Physiol, 1997,273(3):1215-1222.