雌、孕激素受體和人表皮生長因子受體2共表達用于高級別漿液性卵巢癌患者復發預測的價值研究

吳 鵬，朱筧青，鄭智國

卵巢癌是女性生殖系統常見的腫瘤之一，其死亡率居婦科腫瘤之首。據報道Ⅲ期卵巢癌患者的5年生存率僅為29.0%，近幾十年來，其總生存率未得到明顯改善[1]。高級別漿液性卵巢癌在上皮性卵巢癌中占大多數，超過2/3[2]。越來越多的證據表明高級別漿液性卵巢癌有別于其他卵巢癌亞型，幾乎所有高級別漿液性卵巢癌均有P53突變，其他常見突變基因見于控制DNA雙鏈斷裂同源重組修復途徑，如BRCA1/2、PALB2、RAD51、RAD50、BARD1、CHK2和BRIP1等[3]。因而，近年來高級別漿液性卵巢癌受到越來越多科學家的關注。治療后復發是影響高級別漿液性卵巢癌患者存活率的重要因素，大多數進展期高級別漿液性卵巢癌患者在標準治療(減瘤術+化療)后幾個月或幾年內復發。其復發風險明顯受病理分期和術后殘留灶大小影響，但目前的研究還不足以準確地預測患者復發風險，因而還需要尋找更多的復發預測分子標志物，以便更好地指導卵巢癌患者個性化治療[4]。P53、人表皮生長因子受體2(CerbB-2)、雌激素受體(ER)和孕激素受體(PR)的表達情況在卵巢癌患者中的預后價值已有研究[5-6]，而其在高級別漿液性卵巢癌復發的預測價值研究較少。CerbB-2、ER和PR共表達對高級別漿液性卵巢癌中的復發預測價值鮮見報道。本研究應用免疫組化技術檢測高級別漿液性卵巢癌中P53、CerbB-2、ER和PR的表達情況，探討其與患者無復發生存時間(RFS)的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 入選標準：(1)Ⅲ～Ⅳ期高級別漿液性卵巢癌；(2)本院首診并接受手術和鉑類藥物為基礎的化療；(3)標準治療后已治愈且復發后來本院接受后續治療。根據以上標準，選取2002年9月—2011年2月入住本院的高級別漿液性卵巢癌患者32例。患者年齡39～69歲，平均(51.8±7.6)歲；宮頸癌國際婦產科聯盟(FIGO)分期Ⅲ期30例、Ⅳ期2例，且所有標本均經本院病理科確診。高級別漿液性卵巢癌患者RFS≥12個月為預后良好，RFS<12個月為預后差；以12個月為界，將患者分為RFS≥12個月組(18例)和RFS<12個月組(14例)，兩組的平均年齡分別為(51.0±8.1)和(52.8±7.1)歲，差異無統計學意義(t=-0.654，P=0.518)。所有患者或家屬對研究知情同意。

1.2 方法

1.2.1 標本的處理 組織標本用10%中性甲酫溶液及時固定，后經梯度乙醇(75%、85%、95%、100%)脫水，二甲苯透明，浸蠟后石蠟包埋。

1.2.2 免疫組化實驗 采用超敏試劑盒(均購自正規試劑公司)檢測P53、CerbB-2、ER和PR抗體。按試劑盒說明書步驟進行染色，檸檬酸高溫修復，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，將已知陽性片作為陽性對照。實驗結果判斷：以CerbB-2陽性表達位于細胞膜和細胞質，P53、ER和PR陽性表達位于細胞核，呈棕黃色顆粒狀為陽性表達。免疫組化定量分析(半定量)根據細胞著色深度及陽性細胞數分別記分為0～3分，著色深度以多數細胞呈色程度為準。凡細胞核或細胞膜內著淺棕色者為1分、棕色者為2分、深棕色者為3分、不著色為0分；鏡下視野中陽性細胞占所有細胞的比例<10%為1分、10%～50%為2分、>50%為3分。根據上述兩項指標的積分數分為4級，0分為陰性(-)、2～3分為弱陽性(+)低表達、4分為陽性(++)中表達、5～6分為強陽性(+++)高表達[7]。

1.2.3 RFS判斷標準 患者接受標準治療后獲得臨床治愈，RFS為從末次化療到復發時間，復發標準為臨床復發證據(婦科檢查或影像學檢查提示腫塊)出現或血清糖類抗原125(CA125)持續升高。

2 結果

2.1 P53、CerbB-2、ER和PR在高級別漿液性卵巢癌患者中的表達情況 P53蛋白主要定位于細胞核,陽性細胞核被染成棕黃色,胞膜、胞質均無著色；CerbB-2主要表達于細胞膜,細胞膜染成棕黃色，鏡下見陽性細胞呈片狀表達；ER免疫組化染色切片中,可見棕黃色或橘黃色顆粒位于細胞核內，胞質和胞膜未見染色顆粒；PR陽性表達情況與ER類似(見圖1)。32例高級別漿液性卵巢癌患者中，P53、CerbB-2、ER和PR的陽性表達率見表1。

注：CerbB-2=人表皮生長因子受體2，ER=雌激素受體，PR=孕激素受體

圖1 組織切片中P53、CerbB-2、ER和PR表達情況(×400)

Figure1 Expression of P53,CerbB-2,ER and PR in tissue sections

2.2 不同RFS的高級別漿液性卵巢癌患者中P53、CerbB-2、ER和PR陽性表達率的比較 不同RFS的高級別漿液性卵巢癌患者P53、ER和PR的陽性表達率比較，差異無統計學意義(P>0.05)；RFS<12個月組CerbB-2的陽性表達率高于RFS≥12個月組，差異有統計學意義(P<0.05，見表2)。

2.3 不同RFS的高級別漿液性卵巢癌患者CerbB-2、ER和PR共表達情況 進一步對CerbB-2、ER和PR的共表達情況進行分析。以CerbB-2陰性、ER陽性或PR陰性為標準，同一個患者只要符合2個及以上標準即為共表達陽性(表明患者復發風險低)，其余情況為陰性。RFS≥12個月組CerbB-2、ER和PR共表達陽性率高于RFS<12個月組，差異有統計學意義(χ2=7.619，P=0.008，見表3)。

表1 P53、CerbB-2、ER和PR在高級別漿液性卵巢癌患者中的表達情況

Table1 Expression of P53,CerbB-2,ER and PR in high-level serous ovarian cancer patients

抗體例數陽性例數高表達 中表達 低表達陽性總例數陽性率(%)P533214332062.5CerbB-2320681443.8ER3261062268.8PR322181134.4

表3 不同RFS的高級別漿液性卵巢癌患者CerbB-2、ER和PR共表達陽性率的比較〔n(%)〕

Table3 Comparison of the positive co-expression rates of CerbB-2,ER and PR in high-level serous ovarian cancer patients with different RFSs

組別例數CerbB-2、ER、PR共表達為陽性CerbB-2、ER、PR共表達為陰性RFS≥12個月組1815(83.3)3(16.7)RFS<12個月組145(35.7)9(64.3)

3 討論

高級別漿液性卵巢癌是卵巢癌中最常見的一個亞型，臨床診斷時往往為晚期。雖然經過標準治療后大多數患者能夠獲得臨床治愈，但由于其易復發和耐藥等原因，患者的5年生存率僅為35.0%～40.0%[4]。

P53基因是一個經典的抑癌基因，幾乎所有高級別漿液性卵巢癌患者均存在P53突變[3]。K?bel等[8]通過對502例位于骨盆的高級別漿液性卵巢癌患者分析發現P53過表達預示著復發風險小。本研究顯示，不同RFS的高級別漿液性卵巢癌患者P53陽性表達率間無明顯差異，提示P53表達情況與RFS無關，這可能與本研究納入分析樣本數量少和病理分期晚等因素有關。

CerbB-2是一個癌基因，多數研究認為CerbB-2表達陽性的卵巢癌患者預后差[9]。Sueblinvong等[10]研究發現早期上皮性卵巢癌患者CerbB-2過表達與患者預后無關。可見由于納入研究患者的分期不同，即使同一個分子標志物的臨床價值也有差異。本研究結果表明RFS<12個月組CerbB-2的陽性表達率高于RFS≥12個月組，提示CerbB-2陽性患者預后差。結合文獻報道可以推測CerbB-2在晚期卵巢癌細胞中起著重要的生物學功能，其過表達時癌細胞惡性程度更高。

有研究通過對106例卵巢癌患者進行分析，ER和PR陽性表達率分別為39.6%和33.0%，ER陽性表達率在高級別卵巢癌中明顯增加，但ER表達與預后沒有密切關系，而PR與RFS和總生存期(OS)有一定關系(基于單變量分析)[6]。本研究發現ER和PR的陽性表達率分別為68.8%和34.4%，ER陽性表達率明顯高于文獻報道，可能與本研究對象均為高級別漿液性卵巢癌患者有關。但不同RFS的高級別漿液性卵巢癌患者ER和PR的陽性表達率間無明顯差異，提示ER和PR的表達情況與RFS無關。

本研究進一步分析發現CerbB-2陰性、ER陽性或PR陰性(其中符合2個及以上標準)的患者復發風險低，但還需要更多的病例研究來驗證。另外，CerbB-2、ER和PR的共表達是否有明確的生物學功能也還需要進一步研究。

有研究表明，對于完成手術和化療后臨床已完全緩解的卵巢癌患者，隨訪監測發現無癥狀復發患者治療后的總生存率(71.9%)明顯高于有癥狀復發患者(50.7%)[11]。近年各國科學家也致力于卵巢癌首次治療后復發控制的藥物研究，如帕唑帕尼(pazopanib)[12]。然而在實施復發控制前最好能明確哪些卵巢癌患者能從中受益，因此，首次治療后對復發風險的有效預測和復發的早期診斷已經成為業內關注的熱點。本研究提示聯合檢測CerbB-2、ER和PR可作為預測高級別漿液性卵巢癌患者復發風險的潛在標志物，但還需要進一步擴大樣本量來驗證。

表2 不同RFS的高級別漿液性卵巢癌患者P53、CerbB-2、ER、PR陽性表達率的比較〔n(%)〕

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