移動(dòng)克雷伯菌耐藥元件檢測結(jié)果與樣本聚類分析

胡旭軍，劉 鵬，許兆軍，許小敏

(寧波市第二醫(yī)院,浙江 寧波 315010)

筆者選取我院住院病人的臨床標(biāo)本分離到一組耐藥移動(dòng)克雷伯菌,為了解該組菌株的β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類耐藥相關(guān)基因存在狀況,進(jìn)行了相關(guān)基因檢測和突變分析,耐藥元件檢測結(jié)果進(jìn)行了樣本聚類分析，現(xiàn)報(bào)告如下。

一、材料與方法

(一)菌種鑒定。

由2012年1月-2012年12月我院重癥監(jiān)護(hù)病房住院患者中分離菌株。使用全自動(dòng)微生物鑒定儀初步篩查，然后作gyrA與parC基因聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增測序。測得序列經(jīng)GenBank比對(duì)確認(rèn)為移動(dòng)克雷伯菌者。

(二)藥敏試驗(yàn)。

K-B法及VITEK2-compact分析系統(tǒng)的藥敏卡AST-GN13。判斷依據(jù)參照2012年CLSI。

(三)基因檢測模板制備。

取單個(gè)菌落置于預(yù)置4ml濃度為200g/L蛋白酶K溶液的離心管中，加蓋后置于56℃水浴中2h，隨后，放入95℃水浴中10min，即為基因檢測模板，模板放置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

(四)基因檢測。

PCR基因檢測法測定耐藥相關(guān)基因以及gyrA、parC基因；氟喹諾酮類藥物作用靶位基因gyrA與parC經(jīng)PCR擴(kuò)增另作DNA測序。判斷產(chǎn)物陽性。

(五)陽性基因測序。

3730型毛細(xì)血管全自動(dòng)測序儀進(jìn)行PCR產(chǎn)物直接全自動(dòng)熒光法。

(六)測得序列比對(duì)。

讀序軟件為Chromas。測序結(jié)果用Chromas直接作Search比對(duì)。

(七)聚類分析。

耐藥相關(guān)基因檢測結(jié)果及耐藥決定區(qū)突變分析結(jié)果作樣本聚類分析(Neighbour-Joining法)。

二、結(jié) 果

具體檢測結(jié)果如下(見附表、附圖)。

附表 24株耐藥移動(dòng)克雷伯菌39種水平轉(zhuǎn)移獲得與β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類耐藥相關(guān)基因檢測結(jié)果及gyrA與parC之氟喹諾酮耐藥決定區(qū)突變分析結(jié)果

注：標(biāo)*者均經(jīng)測序證實(shí)；檢測為陰性基因的項(xiàng)目表內(nèi)未列出

三、討 論

本次實(shí)驗(yàn)中24株耐藥移動(dòng)克雷伯菌的β-內(nèi)酰胺酶基因和氨基糖苷類修飾酶基因，均測得陽性結(jié)果。gyrA與parC之氟喹諾酮耐藥決定區(qū)突變率均大于50%。可見本組移動(dòng)克雷伯菌耐藥表型有著確鑿的遺傳學(xué)背景[1]。

樣本聚類分析用作解析一組數(shù)據(jù)中樣本之間的關(guān)系[2],在本文中亦即菌株間的親緣關(guān)系，本組中耐藥移動(dòng)克雷伯菌菌株同時(shí)存在克隆和演化。1-6-13-14號(hào)株為克隆播散(已構(gòu)成暴發(fā)流行),并攜帶TEM+aac(6’)-Ⅰb+gyrA(83位)突變+parC(80位)突變,16號(hào)株與該克隆關(guān)系最近(附圖中結(jié)點(diǎn)A),16號(hào)株攜帶TEM+CTX-M-1群+aac(6’)-Ⅰb+gyrA(83位)突變+parC(80位)突變,1-6-13-14號(hào)與16號(hào)株有共同的祖先。3-4號(hào)株為克隆播散(未構(gòu)成暴發(fā)流行),并攜帶tnp-TEM+gyrA(83位)突變+parC(80位)突變,15號(hào)株與該克隆關(guān)系最近(圖1中結(jié)點(diǎn)B),15號(hào)株攜帶tnp-TEM+aac(6’)-Ⅰb+gyrA(83位)突變+parC(80位)

附圖 24株耐藥移動(dòng)克雷伯菌耐藥元件測得結(jié)果樣本聚類分析

突變,3-4號(hào)與15號(hào)株有共同的祖先。8-17號(hào)株為克隆播散(未構(gòu)成暴發(fā)流行),并攜帶TEM+SHV+gyrA(83位,87位)突變+parC(80位)突變,5號(hào)株與該克隆關(guān)系最近(附圖中結(jié)點(diǎn)C),5號(hào)株攜帶TEM+gyrA(83位,87位)突變+parC(80位)突變,8-17號(hào)與5號(hào)株有共同的祖先。2-10-12-18-19-20-22-23-24號(hào)株為克隆播散(已構(gòu)成暴發(fā)流行),并攜帶TEM,21號(hào)株與該克隆關(guān)系最近(附圖中結(jié)點(diǎn)D),21號(hào)株攜帶TEM+gyrA(83位)突變,2-10-12-18-19-20-22-23-24號(hào)與21號(hào)株有共同的祖先。樣本聚類分析顯示本組耐藥移動(dòng)克雷伯菌存在4個(gè)克隆播散,其中2個(gè)已構(gòu)成已構(gòu)成暴發(fā)流行。

最新的研究發(fā)現(xiàn),移動(dòng)克雷伯菌具有較強(qiáng)黏附性和侵襲性,并致單核細(xì)胞凋亡[3],我國已有移動(dòng)克雷伯菌致肝移植者肝膿腫的報(bào)告[4-5]，值得深入關(guān)注。

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[4]陳培服，許小敏，許兆軍.2株耐藥移動(dòng)克雷伯菌β-內(nèi)酰胺酶編碼基因研究[J].全科醫(yī)學(xué)臨床與教育,2013，11(6):608-611.