凍融周期囊胚移植的臨床價值

陳京京,姜 宏，李 攀

(安徽醫科大學解放軍臨床學院生殖醫學中心，合肥 230031)

隨著玻璃化冷凍技術的發展和廣泛應用，凍融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer)不僅可提高胚胎利用率和累計妊娠率，而且有效降低了新鮮周期控制性超排卵所導致的并發癥如卵巢過度刺激綜合征等，已成為輔助生殖技術中重要的組成部分[1]。近年來，序貫培養技術使囊胚培養和移植成為可能，囊胚移植使子宮內膜與胚胎發育同步，更符合子宮的生理著床環境，不僅提高胚胎種植率和臨床妊娠率，并且可通過限制移植囊胚數目達到既可獲得較高的累積妊娠率，又可減少多胎妊娠及其他母嬰并發癥發生的目的[2]。凍融囊胚歷經了冷凍和復蘇的考驗，能夠存活表明其具有更強的生命力和發育潛能，有更高的種植率和臨床妊娠率[3]。本研究通過518個凍融胚胎移植周期臨床資料的回顧性分析，旨在探討冷凍周期囊胚移植的臨床價值以及凍融卵裂期胚胎復蘇后行囊胚移植的應用前景。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2012年9月至2013年7月在本院生殖醫學中心接受凍融胚胎移植患者共518個周期的臨床資料。納入標準：(1)患者年齡均小于或等于38歲。(2)均采用長方案進行控制性超促排卵。按移植凍融胚胎類型分為3組，A組：凍融囊胚移植，共129個周期；B組：卵裂期胚胎復蘇后行囊胚培養后移植，共123個周期；C組(對照)：凍融卵裂胚移植，共266個周期。比較3組間的臨床結局及A、B兩組新鮮周期胚胎和凍融周期的囊胚形成率和取消率。3組間患者的平均年齡、不孕年限、體質量指數(BMI)、轉化日子宮內膜厚度、基礎性激素水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05),見表1。

1.2方法

1.2.1胚胎評分和冷凍 根據卵裂球數目、形態和碎片數目將第3天的卵裂期胚胎分為4級：Ⅰ級：碎片小于5%；Ⅱ級：5%～<20%；Ⅲ級：20%～<50%；Ⅳ級：碎片大于或等于50%，其中6/Ⅱ級以上定義為優質胚胎；根據文獻[1]進行囊胚分級，將3BB 以上囊胚定義為優質囊胚。按照知情同意的原則，選擇第3天剩余3枚以上5/Ⅲ級的胚胎進行囊胚培養，對第3天優質胚胎和第5天 3BC或3CB以上囊胚進行冷凍。卵裂期胚胎和囊胚均采用玻璃化冷凍法進行冷凍，囊胚冷凍前先行激光打孔人工皺縮。

1.2.2胚胎復蘇和凍融囊胚移植 胚胎冷凍3個月后行凍融囊胚移植，所有患者均采用激素替代法準備內膜，即月經周期第3天起口服戊酸雌二醇(商品名：補佳樂，拜耳)4～6 mg/d，第10天陰道超聲監測子宮內膜厚度，根據內膜生長情況調整戊酸雌二醇用量，最大劑量10 mg/d，當內膜厚度大于或等于8 mm時，給予肌內注射黃體酮40 mg/d轉化內膜，3 d后選擇2～3枚存活卵裂期胚胎移植，或5 d后選擇1～2枚存活囊胚移植。存活卵裂期胚胎標準:完整細胞數大于50%，存活囊胚標準為囊胚腔的恢復和擴張。A組與C組胚胎復蘇后培養2 h移植，B組卵裂期胚胎復蘇后培養2～3 d移植，移植后14 d測血或尿人絨毛膜促性腺激素，陽性者為生化妊娠，移植5周后B超檢查發現孕囊確診為臨床妊娠，妊娠12周內胚胎停止發育或流產定義為早期流產。

2 結 果

2.13組患者的臨床結局 A、B組的生化妊娠率(70.5%vs.67.5%)、臨床妊娠率(61.2%vs.58.2%)和胚胎種植率(42.3%vs.40.2%)間差異無統計學意義(P>0.05)，但均顯著高于C組(53.0%、42.5%、23.1%)(P<0.05)。3組間早期流產率、異位妊娠率、多胎妊娠率差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組患者的一般資料和臨床結局比較

a:P<0.05，與A、B組比較。

2.2新鮮胚胎與凍融胚胎的囊胚形成率比較 新鮮胚胎行囊胚培養237個周期共2 388枚胚胎，其中11個周期未形成囊胚放棄移植和冷凍，周期取消率為4.6%(11/237)，培養后獲得囊胚1 081枚，囊胚形成率為45.3%(1 081/2 388)。根據第3天胚胎質量分為優質胚胎組和非優質胚胎組，優質胚胎組共1 413枚胚胎，培養后獲883枚囊胚，囊胚形成率為62.5%(883/1 413)；非優質胚胎組共975枚胚胎，培養后獲198枚囊胚，囊胚形成率為20.3%(198/975)。凍融卵裂期胚胎行囊胚培養139個周期共421個胚胎，其中16個周期未形成囊胚放棄移植，周期取消率為11.5%(16/139)，培養后獲243枚囊胚，囊胚形成率為57.7%(243/421)，顯著高于新鮮周期組(P<0.05)。優質胚胎組和凍融胚胎組的囊胚形成率均顯著高于非優質胚胎組(P<0.05)，而前兩者間差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討 論

3.1凍融囊胚移植與凍融卵裂期胚胎囊胚培養的臨床意義 囊胚是胚胎發育的重要階段，只有質量較好的胚胎才能發育到囊胚階段，而發育潛能差、染色體異常的胚胎常在4～8細胞階段出現發育阻滯，被自然淘汰。8細胞前的胚胎主要依賴母源性基因生長，8細胞后胚胎基因組活化，主要依賴胚胎自身基因生長，有更高的發育潛能[4]。通過囊胚培養可進一步淘汰發育潛能差和具有遺傳缺陷的胚胎，增加胚胎的體外篩選機會，獲得更好的臨床結局。馬文敏等[5]的結果顯示,囊胚移植的胚胎數雖顯著低于卵裂期胚胎,但臨床妊娠率卻顯著高于卵裂期胚胎(52.5%vs.30.0%)。

在體外受精超促排卵過程中，子宮內膜的成熟較自然周期提前2～4 d，而子宮內膜成熟提前3 d以上的移植周期均未獲得妊娠[6]。囊胚移植可使胚胎發育與子宮內膜“種植窗”同步，更符合生理著床時間，同時縮短胚胎移植入子宮腔與著床的時間間隔，且該階段子宮收縮頻率減少，降低了胚胎被排出體外的概率，有利于胚胎著床。本研究的結果也證實，雖然A組移植胚胎數低于C組，但生化妊娠率、臨床妊娠率、胚胎種植率高達70.5%、61.2%和42.3%，均顯著高于C組。

由于凍融囊胚移植具有較好的臨床結局和累計妊娠率，作者對部分復蘇后存活3枚優質卵裂期胚胎的患者進行囊胚培養，以探討凍融后卵裂期胚胎的發育潛能及對凍融周期臨床結局的改善作用。Eftekhar等[7]的結果顯示，復蘇后卵裂期胚胎行囊胚培養能夠提高繼續妊娠率，改善臨床結局。本研究的結果顯示，復蘇后存活卵裂期胚胎的囊胚形成率高于新鮮周期，且臨床妊娠率與凍融囊胚移植相近，顯著高于凍融卵裂期胚胎移植。推測可能與其冷凍前即為優質胚胎，復蘇后存活表明其能夠經過低溫冷凍和復蘇的考驗，具有更高的發育潛能，不僅囊胚形成率高而且移植后臨床妊娠率也顯著提高，可獲得與凍融囊胚相近的臨床結局[8]。建議凍融周期解凍有3個以上存活優質卵裂期胚胎行囊胚培養后移植，不僅可對凍融胚胎進行體外篩選，而且可獲得更好的妊娠結局。

輔助生殖技術臨床應用的并發癥之一就是增加了異位妊娠的發生率，可高達5%[9]，而自然妊娠僅為1%～2%。日本學者加藤修[10]發現，卵裂期胚胎移植后可隨子宮內膜分泌液強流進入輸卵管，在輸卵管內發育成囊胚，在孕激素的作用下，子宮內膜分泌液流變弱，胚胎在輸卵管纖毛的蠕動下重新回到子宮腔內著床。當輸卵管發生病變，蠕動功能異常時，發生異位妊娠的可能性增大。而囊胚移植由于時間推后，黃體酮水平升高避開了子宮分泌液的強流和宮縮導致的負壓，可有效降低異位妊娠的發生。本研究結果顯示，凍融囊胚移植和凍融卵裂期胚胎行囊胚培養后移植的異位妊娠率均低于凍融卵裂期胚胎移植，但兩者間差異無統計學意義。

3.2胚胎質量與囊胚形成率 新鮮周期移植后剩余胚胎行囊胚培養不僅能夠對剩余胚胎進行有效篩選，而且在凍融周期移植可顯著提高種植率和臨床妊娠率[11]。由于只有30%～50%的優質胚胎能夠形成囊胚[12]，囊胚培養的主要弊端就是培養過程中導致的胚胎損耗以及長時間培養導致透明帶的變化，甚至出現無囊胚形成的潛在風險。Hardy等[13]認為，胚胎的質量影響囊胚形成率、囊胚質量和種植率。胚胎碎片不僅干擾細胞之間的連接，不利于細胞的融合、囊胚腔和囊胚的形成[14]，而且釋放的有毒物質損傷其臨近的細胞，減少胞質的體積并耗竭胚胎發育所需的細胞器，造成卵裂球或胞質的損失，最終凋亡。隨著胚胎碎片的增多，囊胚形成率降低，囊胚質量下降。本研究也發現，第3天優質胚胎的囊胚形成率(62.5%)顯著高于非優質胚胎(20.3%)，因此，對第3天大于或等于3個優質胚胎進行囊胚培養，理論上至少可獲得1～2枚囊胚，從而確保囊胚培養的成功。對于第3天形態學評分低的胚胎進行體外延長培養仍有一部分能越過阻滯期發育到囊胚，從中篩選出具有發育潛能、生存能力強、質量好的胚胎。本研究對246枚第3天2細胞或3細胞胚胎進行了觀察，僅有3枚形成囊胚，囊胚形成率僅為1.2%，表明該類胚胎幾乎不具備發育為囊胚的潛能。

總之，本研究認為凍融囊胚移植與凍融卵裂期胚胎復蘇后行囊胚培養后移植可獲得較好的臨床結局，尤其解凍卵裂期胚胎行囊胚培養可獲得較高的囊胚形成率和妊娠率，建議對復蘇后存活3枚優質卵裂期胚胎的患者行囊胚培養后移植。

[1]Gardner DK,Lane M,Stevens J,et al.Blastocyst score affects implantation and pregnancy outcome:towards a single blastocyst transfer[J].Fertil Steril,2000,73(6):1155-1158.

[2]Fisch JD,Rodriguez H,Ross R,et al.The graduated embryo score(GES)predicts blastocyst formation and pregnancy rate from cleavage-stage embryos[J].Hum Reprod,2001,16(9):1970-1975.

[3]Hong SW,Sepilian V,Chung HM,et al.Cryopreserved human blastocysts after vitrification result in excellent implantation and clinical pregnancy rates[J].Fertil Steril,2009,92(6):2062-2064.

[4]Huang CC,Lee TH,Chen SU,et al.Successful pregnancy following blastocyst cryopreservation using super-cooling ultra-rapid vitrification[J].Hum Reprod,2005,20(1):122-128.

[5]馬文敏，李海仙，張靜雯，等．囊胚期胚胎培養與移植的臨床研究[J]．中國婦幼保健，2008，23(32)：4604-4605．

[6]Kuczyński W,Dhont M,Grygoruk C,et al.Rescue ICSI of unfertilized oocytes after IVF[J].Hum Reprod,2002,17(9):2423-2427.

[7]Eftekhar M,Aflatoonian A,Mohammadian F,et al.Transfer of blastocysts derived from frozen-thawed cleavage stage embryos improved ongoing pregnancy[J].Arch Gynecol Obstet,2012,286(2):511-516.

[8]Wang YA,Chapman M,Costello M,et al.Better perinatal outcomes following transfer of fresh blastocysts and blastocysts cultured from thawed cleavage embryos:a population based study[J].Hum Reprod,2010,25(6):1536-1542.

[9]Sowter MC,Farquhar CM.Ectopic pregnancy:an update[J].Curr Opin Obstet Gynecol,2004,16(4):289-293.

[10]加藤修．不孕癥治療的成功之路[M]．上海：上海科學普及出版社，2004：80-90．

[11]張順吉，林戈，盧光琇．卵裂期胚胎、囊胚的玻璃化冷凍解凍的妊娠結果分析[J]．中國現代醫學雜志，2011，21(8)：955-958．

[12]Behr B,Pool TB,Milki AA,et al.Preliminary clinical experience with human blastocyst development in vitro without co-culture[J].Hum Reprod,1999,14(2):454-457.

[13]Hardy K,Stark J,Winston RM.Maintenance of the inner cell mass in human blastocysts from fragmented embryos[J].Biol Reprod,2003,68(4):1165-1169.

[14]Eftekhari-Yazdi P,Valojerdi MR,Ashtiani SK,et al.Effect of fragment removal on blastocyst formation and quality of human embryos[J].Reprod Biomed Online,2006,13(6):823-832.