整合素連接激酶在梗阻性腎病合并腎小管酸中毒中的表達

陳琇萌，俞小敏，張惠麗

(廣州醫科大學附屬第一醫院腎內科 510120)

梗阻性腎病可導致腎小管間質纖維化，慢性腎衰竭的進展與腎小管間質損害和纖維化關系密切。梗阻性腎病常合并腎小管酸中毒，腎小管酸中毒不但加劇腎結石的形成、導致內環境紊亂，而且進一步加重腎小管間質損害和纖維化，加速腎功能衰竭。本研究通過觀察單側輸尿管梗阻(UOO)合并腎小管酸中毒的小鼠模型整合素連接激酶(ILK)的表達，了解腎小管間質纖維化的啟動機制及加重因素，探討腎小管酸中毒在梗阻性腎病中誘導腎小管間質纖維化的作用機制。

1 材料與方法

1.1試劑 Western blot和免疫組織化學法的MMP-9抗體和ILK抗體購自美國Santa Cruz公司，免疫組織化學二抗(小鼠抗兔)購自美國Dako公司，免疫發光二抗(山羊抗兔)購自美國Cell Signaling 公司。

1.2方法

1.2.1動物模型的建立與分組 實驗大鼠由廣州醫科大學動物中心提供，75只清潔級成年雄性大鼠，8～10周齡，體質量150～220 g，分為假手術組(對照，n=25)和UUO組大鼠(n=50)。建立UUO組模型[1](3%水合氯醛腹腔麻醉30 mL/kg)。假手術組除不結扎輸尿管外，其余步驟與UUO組相同。檢測小鼠血、尿鉀和pH值、尿液中可滴定酸和銨離子、尿二氧化碳分壓(PCO2)/血PCO2值，于術后第7天篩選出腎小管酸中毒組(UUO1組,n=31)和非腎小管酸中毒組(UUO2組,n=19)，分4個時期(7、14、21、28 d)處死各組大鼠，取左側部分腎組織置于10%甲醛中，并予石蠟包埋；其余腎組織液氮冰凍，置于-80 ℃保存。

1.2.2血、尿生化檢測 采用生化法檢測血、尿鉀和pH值、尿液中可滴定酸和銨離子、尿PCO2/血PCO2值。

1.2.3腎組織病理學檢查 石蠟組織切片作HE、PAS和Masson染色。采用百分比評分法評估腎小管損傷程度，計算30個高倍視野(×400)腎皮質中出現損害(腎小管擴張、管型、壞死或小管炎、萎縮)的腎小管數目及總腎小管數，以損害的腎小管數占總腎小管數的百分比表示。

1.2.4Western blot法檢測腎組織ILK、纖粘連(FN)蛋白的表達水平 (1)蛋白質抽提、聚丙烯胺凝膠電泳及轉膜。(2)硝酸纖維素(NC)膜置于50 g/L牛奶-TBS溶液中室溫封閉1 h，加入1∶2 000抗大鼠一抗，室溫孵育1 h，1 g/L TBS-Tween溶液洗滌3次，再加入1∶2 000 HRP-conjugated二抗，室溫孵育1 h，1 g/L TBS-Tween溶液洗滌3次，TBS溶液洗滌5 min，Lumi-GLO室溫孵育1 min，暗房中沖洗膠片。(3)半定量方法分析腎組織中ILK、FN蛋白表達水平。

2 結 果

2.1光鏡下腎臟病理改變 與假手術組相比，UUO2組術后7 d腎間質炎癥加重，集合管、腎小管水腫、擴張；14、21 d腎小管基底膜開始增厚、上皮細胞腫脹、變性，后期腎間質出現纖維化改變；28 d時質內有大量肌成纖維增生和纖維結締組織形成，腎小管全程擴張，上皮細胞萎縮。UUO1組在各期病較UUO2組炎癥細胞浸潤和間質纖維化加重，28 d時基本無正常結構的腎小球。

2.2大鼠腎組織ILK與FN蛋白的表達 UUO2組大鼠腎組織中可檢測到FN蛋白的沉積和ILK的表達，UUO1大鼠腎組織FN蛋白的沉積和ILK的表達高于UUO2組。假手術組僅有少量的ILK蛋白表達，幾乎無FN蛋白的沉積，UUO2組ILK蛋白表達及FN蛋白的沉積增多，而UUO1組較UUO2組增多。UUO1、UUO2兩組差異有統計學意義(P<0．01)，見圖1。相關性分析結果表明，腎組織中ILK的表達水平與FN蛋白沉積的程度呈正相關。

1:28 d對照組；2～5：7、14、21、28 d UUO1組；6～9：7、14、21、28 d UUO2組。

圖1大鼠腎組織ILK和FN蛋白的表達情況

3 討 論

梗阻性腎病可致腎小管尤其是其遠端的管腔負電位無法維持(電壓依賴型)，使泌氫入管腔的速率減慢，導致非分泌缺陷性酸化功能障礙，即遠端腎小管酸中毒。臨床表現為尿中可滴定酸和銨離子減少、尿pH上升(>6.0)、血pH下降(正常陰離子間隙的高氯性代謝性酸中毒)、低鉀血癥及鈣磷代謝障礙等。腎小管酸中毒不僅造成內環境的紊亂、泌尿系結石形成，更可能造成腎小管受損，最終導致腎間質-小管纖維化。腎小管間質纖維化是梗阻性腎病進展為終末期腎衰竭的最終路徑之一。

在慢性腎衰竭腎間質纖維化過程中，會產生多種細胞因子、生長因子及血管活性物質。上皮細胞向肌成纖維細胞的轉分化是參與腎小管間質纖維化的重要機制之一[2]。轉分化受多種細胞因子、生長因子和激素的調節，值得強調的是，TGF-β1誘導轉分化的過程是在病理狀態下導致腎間質纖維化的主要途徑。而目前研究認為，梗阻性腎病時局部和系統產生的細胞因子和血管活性物質激活細胞，使浸潤的單核巨噬細胞及轉分化的細胞分泌細胞外基質顯著增多。其中構成細胞外基質的重要組成FN蛋白在間質中大量聚積是導致腎小管間質纖維化的病理基礎[3]。TGF-β1具有多種生物學功能，其中以在組織器官免疫以及非免疫損傷后瘢痕和纖維化形成過程中的作用最令人關注，是迄今為止發現的在纖維和結締組織基質發生過程中最為主要的細胞因子。TGF-β1的高表達在腎臟纖維化的形成中的作用已明確，TGF-β1族細胞因子通過不同信號傳導途徑產生多種生物效應，其中Smads家族蛋白是其細胞內信號傳導通路中的重要因子[4]。參與TGF2/Smad這一信號傳導途徑的Smads家族蛋白主要有Smad2、3、4、7。Snail抑制E-鈣黏蛋白破壞上皮細胞極性,將上皮細胞轉換成間充質細胞；Snail上調基質金屬蛋白酶的表達破壞小管基底膜；國外學者認為Snail和LEF-1轉錄抑制的相互作用是TGF2-β1誘導的上皮細胞間質轉化的必須因素。而ILK是其信號傳導途徑的效應分子，介導了TGF2-β1誘導腎小管轉分化的各個關鍵步驟。

Li等[5]提出TGF-β1-Smad-ILK-EMT軸的存在，ILK在TGF-β誘導的EMT可能起關鍵作用。ILK能夠調節FN蛋白的組裝與沉積，即促使細胞產生的分泌型FN轉分化組裝成不溶的FN而直接沉積于細胞間隙，以此參與細胞外基質的聚積[6]。ILK是1996年Hannigan以β1整合素胞質域為誘餌，應用酵母雙雜交系統發現的一種具有多種功能的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，ILK能通過與整合素β1亞單位胞內域相互作用，介導細胞與細胞外基質(如FN蛋白)的連接[7-8]。Li等[9]發現細胞與基質積聚的相互作用是由ILK介導完成，與腎臟病變程度相關。ILK能夠直接參與細胞形態學的改變以及細胞的生長、分化和基因表達。在腎間質纖維化過程中，ILK是誘導轉分化的關鍵調節因子，可能參與腎小管上皮細胞-肌成纖維細胞轉分化的關鍵步驟。有研究表明，在正常腎間質中無或僅有極少量ILK表達，隨腎間質病變程度的加重，ILK表達量明顯增加，腎小管上皮細胞病變越重表達越強，萎縮變性的腎小管表達最為強烈[10]。

本研究通過動物實驗發現，合并腎小管酸中毒的UUO大鼠較未合并腎小管酸中毒的UUO大鼠腎組織ILK蛋白的表達與FN蛋白的沉積上升。因此認為梗阻性腎病合并腎小管酸中毒，加速了腎小管間質纖維化，與ILK的高表達及FN蛋白的沉積相關。本研究探討的腎小管酸中毒通過上調ILK介導梗阻性腎病FN蛋白沉積的成因，不僅有利于認識梗阻性腎病合并腎小管酸中毒導致腎小管間質纖維化的啟動機制及加重因素，而且有助于在此基礎上發展防治梗阻性腎病的新措施。

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