胃癌中P53誘導相關微小RNA靶基因預測及生物信息學分析*

曹 輝，許 鐘，白班俊，張玲玲

(貴州省人民醫院:1.腫瘤科;2.消化內科，貴陽 550002)

微小RNA (miRNA)通過使其靶mRNA的降解或翻譯抑制，在轉錄后水平調控基因表達[1]，參與調控細胞的增殖、分化及腫瘤發生、發展等生理和病理過程，因而受到廣泛關注。多項研究對胃癌臨床標本檢測發現，相對于癌旁組織，胃癌中出現多種miRNA表達的異常上調或下調；同時，miRNA的表達也受到多種轉錄因子的調控，如P53可誘導miR-34a、miR-26b、miR-92、miR-29a、miR-25、miR-103、miR-128a等一系列miRNA的表達上調[2]。對野生型P53胃癌來說，探討P53通過miRNA間接作用參與腫瘤的發生有助于深入理解該類腫瘤的發生機制。本研究擬通過生物信息學預測胃癌中P53誘導相關miRNA的靶基因，并進一步對其靶基因進行功能富集分析和信號轉導通路富集分析，為后續的表達調控實驗奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1目標miRNA的篩選 通過在線人類疾病相關microRNA數據庫mir2disease[3]，檢索胃癌中高表達的miRNA；用檢索結果與P53誘導相關miRNA對比，取交集得到胃癌中P53誘導相關miRNA。

1.2靶基因的預測 確定目標miRNA后，利用在線預測軟件miRNA 靶基因數據庫miRGen(v3.0)進行靶基因預測(含PicTar、miRanda、DIANA-microT、TargetScanS 等miRNA 靶基因預測工具)[4]，得到目標miRNA的候選靶基因數據集。

1.3確立胃癌中的預測靶基因 通過在線基因表達譜數據庫Gene Expression Atlas[5]檢索獲得胃癌中表達下調的基因，用預測的候選靶基因數據集與之比對，獲得胃癌中目標miRNA的靶基因數據集。

1.4功能富集分析 通過在線軟件DAVID[6]對預測的靶基因數據集進行功能富集分析；Pathway Miner進行信號轉導通路分析。

2 結 果

2.1目標miRNA的篩選情況 應用在線mir2disease數據庫檢索胃癌相關miRNA，根據其詳細注釋篩選出在胃癌中表達上調的基因，共18個；匯總胃癌中高表達的miRNA與P53誘導相關miRNA[2]兩者對比，初步獲得本研究候選miRNAs，見圖1。

圖1 目標miRNA篩選圖

2.2miR-21靶基因的預測 從候選目標miRNA中選擇文獻報道較多的miR-21，通過在線軟件預測其靶基因，用集成常用預測工具的miRGen(v3)分析，結果共獲得1 090個基因。

2.3確立胃癌中的預測靶基因 應用在線基因表達譜數據庫Gene Expression Atlas檢索，選擇 “(All genes) and down in gastric carcinoma”，限定為“Homo sapiens”，獲得胃癌中表達下調的基因共2 737個，用預測的1 090個候選靶基因數據集與之比對，獲得胃癌中目標miRNA的靶基因數據集共115個，見表1。

2.4功能富集分析結果 應用DAVID進行Gene_Ontology分析時，選擇系統默認的GOTERM_BP_FAT、GOTERM_CC_FAT、GOTERM_MF_FAT 3個庫，其中P<0.01部分結果見表2。通過Pathway Miner分析相關信號通路(表3)，細胞調節通路包括黏附連接、脂肪細胞因子信號轉導通路、胰島素信號轉導通路、細胞凋亡、鈣信號轉導通路、JAK-STAT信號轉導途徑等，代謝途徑包括賴氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解、丁酸代謝、脂肪酸代謝、丙酮酸代謝等，見圖2。

表1 胃癌中miR-21的靶基因預測與篩選結果

-：此項無數據。

表2 應用DAVID進行Gene_Ontology功能富集分析(部分)

續表2 應用DAVID進行Gene_Ontology功能富集分析(部分)

表3 Pathway Miner分析中KEGG部分相關信號通路名稱

圖2 Pathway Miner分析中部分信號通路涉及基因(KEGG)

3 討 論

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，在胃黏膜癌變過程中，P53等多種抑癌基因的變化參與了胃癌形成。P53和多種轉錄因子之間存在著相互作用，但仍難以充分闡明胃癌發生機制。近年來發現P53可影響一組miRNA的表達[2]，為本研究提供了新的契機。

miRNA作為一類具有調控基因表達的非編碼RNA(約18～22 nt)，通過使其靶mRNA的降解或翻譯抑制，在轉錄后水平調控基因表達[1,7]。miRNA通過這種機制參與調控細胞的增殖、分化及腫瘤發生、發展等生理、病理過程。同時，miRNA的表達也受到多種轉錄因子的調控，P53可誘導一系列miRNA的表達上調[2]。通過對胃癌臨床標本的檢測，發現相對于癌旁組織，胃癌中出現多種miRNA表達的異常表達，如mir-34、mir-128a、miR-92、miR-25、miR-103等的上調，mir-128b、mir-129、mir-148等的下調[8-10]。正是由于miRNA與轉錄因子之間存在相互調控作用，推測在野生型P53胃癌中，P53可能在誘導miRNA的表達后，進而通過miRNA對下游基因的轉錄后水平調控，從而促進腫瘤的發生。因此，作者進行了相關生物信息學分析，為后續研究提供理論基礎。

通過在線數據的深度挖掘，成功縮小胃癌中目標miRNA分析范圍。miR-21與胃癌的發生和轉移有關，有望作為胃癌分子標志[11]，選擇其進一步分析預測靶基因。經過整合常用miR靶基因預測軟件的靶基因數據庫miRGen(v3)進行靶基因預測后，應用基因表達譜數據庫有效縮小靶基因范圍，獲得在胃癌中相關的預測靶基因集。應用在線軟件DAVID和Pathway Miner分別進行GO基因注釋、功能富集分析和信號通路分析。結果顯示在胃癌中MiR-21的靶基因涉及系列信號通路中，包括黏附連接、胰島素信號轉導通路、細胞凋亡、鈣信號轉導通路、JAK-STAT信號轉導途徑等與腫瘤發生、發展及轉移密切相關的信號通路[12-13]。

經過充分數據發掘，利用生物信息學分析結果所提供的重點信號轉導通路為基礎，可以開展針對性的實驗研究，將有助于進一步理解P53、miRNA及下游靶基因組成的調控網絡在胃癌發生、發展中的作用機制。

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