雌激素對異丙腎上腺素誘導的大鼠心肌損傷及心肌細胞凋亡的影響*

張 洋，武 煜，王紅軍，孟 晶，劉功儉△

(1.徐州醫學院麻醉學院，江蘇徐州 221002；2.江蘇省徐州市第一人民醫院內科 221000)

研究顯示心肌收縮功能降低是各種心血管疾病造成心臟泵血能力降低的主要原因。流行病學調查發現，男性和女性的心血管疾病發病率和嚴重程度存在明顯差異，且絕經前婦女心血管疾病的發生率明顯低于同年齡男性[1-2]，這表明雌激素對于維持心血管健康起重要作用[3-4]。然而，這種心肌保護作用的機制尚不清楚。

心血管疾病致病因素當中，交感腎上腺髓質系統活動增強在中老年患者當中尤為重要，過度增加的兒茶酚胺分泌會造成急性或慢性心肌損傷，對于絕經后婦女兒茶酚胺的作用更為明顯[5]。有實驗證據表明，細胞凋亡是心肌損傷的重要原因[6]，損傷后的心肌收縮功能明顯下降。已有研究發現，凋亡相關蛋白Bax的高表達和Bcl-2的低表達與凋亡的活化有關[7-8]，而兒茶酚胺過多會造成心肌細胞凋亡，心肌損傷，心功能下降[9]。因此，藥物方法抑制心肌細胞凋亡可能是保護因兒茶酚胺過多造成心肌損傷的治療靶點[10]。因此，本研究旨在闡明雌激素替代治療對異丙腎上腺素造成心肌損傷的保護作用，并證明雌激素保護心肌的機制為抑制異丙腎上腺素造成的心肌細胞凋亡。

1 材料與方法

1.1實驗材料與動物分組 正常健康SD 雌性成年大鼠50只，體質量200～250 g,由徐州醫學院實驗動物中心提供(使用許可號：SYXK[su]2002-0038)。實驗主要試劑：異丙腎上腺素購自Sigma公司(美國)，17β 雌二醇購自ABCR公司(德國)，一抗Caspase-3、Bcl-2、Bax、GAPDH與二抗均購自Santa Cruz公司(美國)。實驗動物由戊巴比妥鈉60 mg/kg麻醉,切除雙側卵巢。3 d后皮下注射異丙腎上腺素100 mg·kg-1·d-1,連續5 d[5]。參照本實驗室既往研究[11]，實驗動物分組為假手術組(Sham組)、雙側卵巢切除組(OVX組)、心肌損傷組(OVX+ISO+Vehi組)、雌激素4 μg·kg-1·d-1治療組(OVX+ISO+ E2a組)、雌激素40 μg·kg-1·d-1治療組(OVX+ISO+E2b組)。OVX+ISO+Vehiz組和OVX+ISO+E2a組分別皮下注射17β 雌二醇與溶劑連續4周。

1.2方法

1.2.1大鼠血流動力學測定 雌激素替代治療4周后，測量身長，大鼠戊巴比妥鈉60 mg/kg麻醉后，左側頸總動脈置入微壓力傳感導管，檢測平均動脈血壓(MABP)、左心室舒張末期壓力(LVEDP)、左心室壓力變化速率(±dp/dt)[12]。

1.2.2成年大鼠心肌細胞分離和培養 分離和培養成年大鼠心肌細胞的方法如作者之前的研究[13]，簡而言之，SD大鼠，麻醉后迅速開胸取心臟，稱體質量，Langendorff主動脈逆行灌流無鈣酶液(含0.04%膠原酶)，循環灌流20～30 min，將心室組織剪成約1 mm×1 mm×1 mm碎塊，然后用200目尼龍網過濾，室溫下靜置20 min，棄上清，反復3次，最后將細胞置于CO2培養箱中。

1.2.3培養心肌細胞存活率的計算 倒置顯微鏡采集橫紋清晰、胞膜完整、長桿狀的心肌細胞(放大200倍)測算心肌細胞桿狀存活率，心肌細胞肝狀存活率=(桿狀細胞數量/全部細胞數量)×100%。

1.2.4單個心肌細胞收縮功能的測定 倒置顯微鏡(Nikon E400)視頻記錄心肌細胞收縮功能的方法如作者之前的研究[13 ]，把培養的心肌細胞置于收縮功能分析裝置的細胞浴槽內,2 mmol/L鈣和10-7mmol/L 異丙腎上腺素的KH液灌流，0.5 Hz電刺激。采集橫紋清晰、胞膜完整、長桿狀的心肌細胞(放大200倍)分析其收縮的狀況，以及收縮時間(TTP)、舒張90%時間(R90)，心肌細胞收縮幅度(%)=(心肌細胞舒張末長度-收縮末長度)/心肌細胞靜息長度×100%。

1.2.5流式細胞儀檢測細胞凋亡 Annexin V-PI雙染色法標記分離培養的心肌細胞，經流式細胞儀檢測細胞凋亡率。每樣本細胞數控制為(1～5)×106/mL，500～1 000 r/min離心5 min，棄去培養液。加入熒光(SA-FLOUS)溶液4 ℃下孵育20 min，流式細胞儀檢測。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞；右上象限是非活細胞，即壞死及凋亡細胞。

1.2.6Western blot檢測蛋白表達 凋亡相關蛋白Caspase 3、Bcl-2和Bax蛋白通過Western blot方法檢測。等量蛋白樣品(20 μg)加入10% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳 (SDS-PAGE)分離，轉膜后加入一抗(1∶1 000)4 ℃過夜，二抗(1∶3 000)室溫孵育2 h。Image J3.0軟件分析。

2 結 果

2.1外源性雌激素替代治療對大鼠一般指標的影響 為了檢測雌激素在心泵功能中的作用，將雌性大鼠雙側卵巢切除，該模型可以明顯降低血中雌激素水平，隨后注射異丙腎上腺素，子宮切除后的雌性大鼠，血漿中雌激素水平(圖1A)、子宮體質量(圖 1B)顯著降低，但是大鼠身長沒有改變(本文沒有顯示該數據)。與Sham組和OVX組比較，OVX+ISO+Vehi組心臟質量與心臟質量/身長比率增加(圖 1C、D)。而OVX+ISO+E2b組較OVX+ISO+Vehi組血漿雌激素水平與子宮質量顯著增加(圖 1A、B)，并且降低了由于ISO刺激而引起的心臟質量與心臟質量/身長比率(圖 1C、D)。但是較低劑量的雌激素(4 μg·kg-1·d-1)對血漿雌激素水平升高不明顯(圖 1A)，而且對恢復子宮質量的作用非常有限(圖 1B)。在實驗中，還發現較低劑量的雌激素(4 μg·kg-1·d-1)對于異丙腎上腺素所導致的心臟質量和心臟質量/身長比率的增加幾乎沒有作用(圖 1C、D)。

A：血漿雌激素水平；B：子宮質量；C：心臟質量；D：心臟質量/身長。*：P<0.05，與Sham組比較；#：P<0.05，與OVX+ISO+Vehi組比較。

A：MABP水平；B：LVEDP水平；C：±dp/dt水平；D：-dp/dt水平。*：P<0.05,與sham組比較；#：P<0.05,與OVX+ISO+Vehi組比較。

2.2外源性雌激素替代治療改善異丙腎上腺素造成的心肌收縮功能降低 經大鼠左側頸總動脈置管，并逆行進入左心室記錄各組大鼠的血流動力學指標。與Sham組和OVX組比較，OVX+ISO+Vehi組平均動脈血壓(MABP)與左室舒張末壓(LVEDP)明顯升高(圖 2A、B)，但是±dp/dt顯著降低(圖2C、D)。而OVX+ISO+E2b組較OVX+ISO+Vehi組MABP與LVEDP明顯降低(圖 2A、B)，±dp/dt升高(圖2C、D)。但是OVX+ISO+Vehi組對于ISO所導致的MABP、LVEDP升高，±dp/dt降低幾乎無作用(圖 2A～D)。

2.3外源性雌激素替代治療對單個心肌細胞的影響 通過倒置顯微鏡觀察記錄各組分離培養的單個成年大鼠心肌細胞，在體外經電刺激收縮搏動的影像。Sham組與OVX組單個心肌細胞橫紋清晰、包膜完整，細胞長度與直徑正常，而OVX+ISO+Vehi組心肌細胞明顯肥大，不規則，細胞長度與直徑明顯增加，而OVX+ISO+E2b組心肌細胞形態明顯改善，但OVX+ISO+E2a組心肌細胞形態恢復的極為有限。見圖3。

A：Sham組;B:OVX組;C:OVX+ISO+Vehi組;D:OVX+ISO+E2a組;E:OVX+ISO+E2b組。A、B、E放大倍數為400倍；C、D放大倍數為200倍。

圖3各組大鼠單個心肌細胞光學顯微鏡觀察

A：心肌細胞桿狀率；B：收縮幅度；C：TTP；D：R90。*：P<0.05，與sham組間比較；#：P<0.05,與OVX+ISO+Vehi組間比較。

同時也發現，與Sham組或OVX組相比，OVX+ISO+Vehi組心肌細胞桿狀率、收縮幅度明顯降低(圖 4A、B)，TTP及R90明顯延長(圖 4C、D)。而OVX+ISO+E2b組相對于OVX+ISO+Vehi組心肌細胞的桿狀率、收縮幅度顯著增加(圖 4A、B)，而TTP與R90則明顯下降(圖 4C、D)。但是OVX+ISO+E2a組心肌細胞的這種恢復作用幾乎沒有(圖 4A～D)。

2.4外源性雌激素替代治療對心肌細胞凋亡的影響 分離培養的心肌細胞經Annexin V-PI雙染色法標記，流式細胞儀檢測細胞凋亡率(圖 5A～E)，與Sham組或OVX組相比，OVX+ISO+Vehi組心肌細胞凋亡率顯著增加(圖 5F)，而OVX+ISO+E2b組相對于OVX+ISO+Vehi組心肌細胞凋亡率顯著下降，但是OVX+ISO+E2a組心肌細胞凋亡率下降沒有OVX+ISO+E2b組明顯，且與OVX+ISO+Vehi組相比差異無統計學意義(P>0.05)(圖 5F)。

A～E：雙染色標記法；F：流式細胞儀檢測細胞凋亡率。*:P<0.05,與sham組間比較；#:P<0.05,與OVX+ISO+Vehi組間比較。

A：Caspase 3表達；B：Bax表達；C:Bcl-2表達。*：P<0.05，與sham組間比較；#：P<0.05，與OVX+ISO+Vehi組間比較。

2.5外源性雌激素替代治療對心肌細胞Caspase 3、Bcl-2、Bax表達的影響 利用Western blot分析心肌細胞中凋亡相關蛋白Caspase 3、Bcl-2、Bax的表達情況。與Sham組或OVX組相比，OVX+ISO+Vehi組心肌細胞Caspase 3、Bax表達顯著增加(圖 6A、B)，而Bcl-2表達降低(圖 6C)。與OVX+ISO+Vehi組比較，OVX+ISO+E2b組心肌細胞Caspase 3、Bax表達明顯降低(圖 6A、B)，而Bcl-2表達增高(圖 6C)。但是OVX+ISO+E2a組心肌細胞Caspase 3、Bcl-2、Bax的表達與OVX+ISO+Vehi組相比，差異無統計學意義(P>0.05)(圖 6A～C)。

3 討 論

絕經前女性心血管疾病的發病率較低，但更年期后這種優勢明顯降低，這表明雌性激素，尤其是雌激素在減少心血管疾病風險中起到舉足輕重的作用[14]。而且，隨著絕經后女性年齡的增長，其心血管疾病的發病風險也逐步增加，這與逐漸減少的血漿雌激素水平直接相關。而無論女性還是男性，雌激素均可改善血管舒張反應，降低缺血造成的心肌損傷[15]。所以，雌激素也許對心肌具有直接的保護作用。

在心肌損傷大鼠的離體心臟中，沒有太多的證據可以表明心肌收縮功能的改變與細胞凋亡間的關系。而目前的研究表明，雌激素環境對心臟非常重要，在異丙腎上腺素刺激造成心肌損傷之后進行雌激素替代治療，通過測量在體心臟MABP、LVEDP和±dp/dt，發現心臟收縮功能明顯改善。而且通過維持卵巢切除后雌性大鼠的血漿雌激素水平，可以增加單個心室肌細胞收縮功能，減少心肌細胞凋亡蛋白的表達。同時驗證了雌性大鼠卵巢切除動物模型血漿雌激素水平和子宮質量降低，是可以通過雌激素連續替代治療得以恢復的。通過視頻記錄了分離培養的成年大鼠單個心室肌細胞受電刺激而收縮的動態圖像，從中截取了照片觀察心肌細胞形態改變，結果發現異丙腎上腺素連續大劑量刺激可引起心肌細胞肥大，長度與直徑均有不同程度的增加，而收縮幅度與速率則明顯降低。通過連續皮下注射雌激素后，心肌細胞的形態與功能均有不同程度的改善，尤以高劑量雌激素(40 μg·kg-1·d-1)替代治療改善顯著，而低劑量雌激素(4 μg·kg-1·d-1)的恢復效果不甚明顯。這表明雌激素在40 μg·kg-1·d-1劑量可以明顯改善異丙腎上腺素引起的心肌受損。

此外，本研究利用Annexin V-PI雙染法標記分離培養的成年大鼠心肌細胞，經流式細胞儀分析發現，大劑量異丙腎上腺素連續刺激明顯增加心肌細胞凋亡數量，但經雌激素40 μg·kg-1·d-1替代治療4周后凋亡數量明顯減少，而4 μg·kg-1·d-1作用不明顯。心肌細胞凋亡是心肌損傷的主要原因之一[16]。有研究表明，Bcl-2家族蛋白在調節生理和病理性細胞凋亡中發揮關鍵作用，這些蛋白質包括促進細胞死亡的Bax、Bad和抑制細胞死亡的Bcl-2、Bcl-x等[17]。誘導和抑制細胞凋亡的蛋白相互作用，形成一個復雜的調控網絡，而細胞的存活或者死亡的調控基于這個網絡中促凋亡和抗凋亡蛋白的比率[18]。已經明確的是Bax/Bcl-2蛋白比率增高可以明顯促進細胞凋亡[19]。本研究證實經雌激素40 μg·kg-1·d-1劑量持續4周的替代治療可以上調Bcl-2，同時下調Bax的表達，而4 μg·kg-1·d-1的治療劑量并沒有明顯作用。這些結果顯示，雌激素替代治療可以防治兒茶酚胺類激素過多而引起的心肌細胞凋亡，從而保護受損的心肌細胞。因此，作者認為補充雌激素可能是通過上調抗凋亡蛋白，下調促凋亡蛋白的表達而發揮心肌保護作用的。雌激素替代治療調節Bcl-2和Bax蛋白的機制尚不清楚，雌激素調節細胞凋亡相關基因的機制亦不明確。但是雌激素替代治療會引起許多抗氧化劑影響細胞凋亡基因的表達，所以，雌激素的抗氧化與抗脂質過氧化的作用可能是其主要機制[20]。

綜上所述，雌激素替代治療，尤其是40 μg·kg-1·d-1劑量，可以明顯改善由于異丙腎上腺素刺激增加心肌細胞凋亡而造成的心肌損傷、心肌收縮功能下降。而且此濃度的雌激素替代治療可能對卵巢功能不足而引起的心肌收縮功能降低起到保護作用。本研究還表明，增加Bcl-2蛋白、減少Bax蛋白的表達在雌激素心臟保護作用中起到了至關重要的作用。所以，適宜劑量的雌激素替代治療對于兒茶酚胺類激素異丙腎上腺素增加造成的心肌細胞凋亡、心肌收縮功能降低具有明顯的保護作用。

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