蛇毒鑒定的研究進展

張經碩，向 平，沈 敏

（1.司法部司法鑒定科學技術研究所上海市法醫學重點實驗室，上海200063；2.蘇州大學醫學部，江蘇蘇州215123）

1 概述

毒蛇咬傷常見于熱帶和亞熱帶地區。在非洲、亞洲、大洋洲和拉丁美洲的農村地區，毒蛇咬傷是特別突出的公共衛生問題[1-2]。最近的一項研究估計：全球范圍內，每年遭受毒蛇咬傷超過50 000 000人，導致死亡25 000～125 000人[2]。我國蛇傷發病主要在南方各省[3]，以夏秋季多見。據報道我國每年被毒蛇咬傷超過100 000人，其中有將近10 000人會死亡[4]。近年來，由于環境改變、飼養蛇、野外作業等多種因素，蛇傷發病還呈現出逐年增多的趨勢。

在法醫工作中，懷疑是蛇毒中毒的案件經常發生，確定是否是蛇毒中毒，是哪種蛇毒中毒，是解決該類案件的關鍵。目前，我國的蛇傷鑒定方法主要是依靠觀察牙痕、癥狀和生化常規檢查，其中牙痕是關鍵。但是，在實際工作中又經常會碰到沒有明顯牙痕的案件，這時就得憑經驗通過癥狀和生化指標來判斷是否是蛇毒中毒、是哪種蛇毒中毒，錯誤判斷的可能性非常大，因此，我們亟需新的鑒定技術。為此，筆者收集了國內外已報道的蛇毒鑒定技術和蛇毒中毒生物標記物的研究方法，詳細分析了這些方法的優缺點，以期找到更為準確可靠的蛇毒中毒鑒定新方法?，F將國內外的相關研究進展綜述如下。

2 蛇毒的種類

蛇毒是復雜的混合物，其毒性成分主要是具有酶活性的蛋白質和多肽。蛇毒對機體的作用很復雜，按其有毒成分的毒理作用可分為神經毒、血液毒和混合毒，按其作用性質不同又可分為神經毒素、心臟毒素、溶血毒素、凝血毒素和抗凝血毒素[5]。

蛇毒是蛇類用于捕食和消化的工具，不同種類的蛇毒其所含的蛋白質和多肽是不同的[6]，這為鑒定是否為蛇毒中毒以及區分不同的蛇毒中毒提供了可能性。

3 蛇毒中毒的毒理機制

3.1 神經毒素作用機制

蛇毒神經毒素主要是β-神經毒素和α-神經毒素，分別作用于神經突觸和終板。β-神經毒素可以抑制乙酰膽堿釋放，而α-神經毒素可以競爭結合乙酰膽堿受體，兩種毒素均可以通過阻滯神經信號的正常傳導而引起肌肉麻痹的癥狀[7]。早期表現為眼瞼下垂、吞咽困難，進而呼吸肌麻痹導致呼吸衰竭，甚至呼吸停止。

3.2 心臟毒素作用機制

心臟毒素又稱為細胞毒素，其可以引起細胞膜通透性改變和組織壞死，輕者引起肢體腫脹和皮膚壞死，重者可導致局部組織大面積深度壞死，導致患肢殘廢，甚至還可以使心肌細胞壞死從而造成心肌損壞[8]。

3.3 溶血毒素作用機制

蛇毒中有溶血作用的毒素主要是磷脂酶A2，其作用底物為Sn-3-磷酸甘油酯第二位酯鍵，當其作用于血清或卵磷脂時產生溶血卵磷脂，導致紅細胞溶血。磷脂酶A2也可直接作用于紅細胞膜上的磷脂，引起直接溶血[9]。

3.4 凝血毒素作用機制

凝血毒素是蛇毒中存在的一類能作用于血液凝固酶促級聯反應過程中一個或多個環節的蛋白質，可以激活凝血因子Ⅴ、凝血因子Ⅶ、凝血因子Ⅸ、凝血因子Ⅹ、凝血因子Ⅱ或直接使纖維蛋白原凝集[10]。

3.5 抗凝血毒素作用機制

蛇毒中的抗凝血毒素主要是類凝血酶和纖溶酶[11]。蛇毒類凝血酶在體內可以消耗纖維蛋白原，造成纖維蛋白原缺乏而產生抗凝血作用。蛇毒纖溶酶在體內可以降解纖維蛋白和纖維蛋白原，還可以水解和滅活凝血酶原、凝血因子Ⅴ、凝血因子Ⅶ、凝血因子Ⅷ、凝血因子Ⅻ，從而產生抗凝血作用。

4 鑒定方法

自20世紀70年代起，醫學界涌現了大量研究蛇毒和蛇傷鑒定的新技術。從早期的凝集測試法、免疫電泳法、放射免疫法和酶聯免疫吸附法，到近期的聚合酶鏈反應、熒光免疫法、光學免疫法、生物傳感器、基質輔助激光解析離子化質譜和電噴霧離子化質譜，眾多新技術的出現，使得通過傷者體內蛇毒檢測進行蛇傷法醫鑒定具備了可行性。

蛇毒中的毒素蛋白質進入傷者體內后會迅速被體液稀釋，并擴散至全身多個組織，與傷者的內源物質混存，這一方面導致體內毒素蛋白質的濃度極低，另一方面也導致體內蛇毒的鑒定極易被內源物質干擾，因此，鑒定方法的靈敏度和抗干擾能力至關重要。經各國學者研究，一些新技術在體內蛇毒鑒定方面表現出了優異的性能，其檢測靈敏度和排除生物樣品中內源物質干擾的能力非常突出，已經可以嘗試應用于臨床蛇傷的鑒定；但是，也有一些方法經研究發現其檢測靈敏度和抗干擾能力不足，暫時還只能用于純蛇毒的鑒定。

4.1 聚合酶鏈反應法（polymerasechain reaction，PCR）

PCR是一種用于體外放大和擴增特定DNA片段和RNA片段的技術，類似于DNA的體內復制。首先將待擴增的DNA模板加熱變性解鏈，隨之將反應混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發生退火，再將溫度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。這種熱變性-復性-延伸的過程就是一個PCR循環，PCR就是在合適條件下這種循環的不斷重復。

2001年，Suntrarachun等[12]首次采用PCR方法鑒定蛇傷，試圖區別孟加拉眼鏡蛇咬傷與當地的其它蛇類咬傷（眼鏡王蛇、金環蛇、圓斑蝰蛇和紅口腹蛇）。他們選擇了眼鏡蛇毒素（Cobrotoxin）作為引物，將蛇傷小鼠傷口清洗液中的DNA和RNA擴增后用于對蛇種的鑒定。Suntrarachun確實檢測到了一段眼鏡蛇毒素編碼基因中的cDNA片段，并且該cDNA片段的特異性還不錯（在當地其它蛇毒中檢測不到），但是考慮到蛇咬的傷口通常比較小，并且也不會總是殘留足夠的毒腺上皮細胞（這將導致鑒定結果的準確性較差），所以Suntrarachun并沒有將該方法應用于人類傷者身上。

PCR技術是一種非常成熟的擴增基因的方法，Suntrarachun創造性的將其應用于生物樣品中蛇毒的鑒定研究，這為蛇傷鑒定指出了一條新思路。雖然鑒于鑒定結果的準確性問題，Suntrarachun并沒有將這一技術完善成可供實際蛇傷案件使用的方法，但是在個別案件中還是可以考慮嘗試一用。

4.2 凝集測試法（agglulinalion assay）

凝集試驗是一種免疫學檢測方法，需要將抗原與含有相應抗體的血清混合，使二者發生特異性結合形成抗原抗體復合物，在一定濃度的電解質作用下，復合物表面的電荷大部分被消除而失去了互相排斥的作用，于是復合物之間互相吸引凝集成團，出現肉眼可見的凝集現象。

1991年，Chinonavanig等[13]以凝集測試技術為基礎開發了一種反向乳膠凝集方法用于檢測蛇毒。Chinonavanig獲得的體外測試結果顯示，該方法檢測蛇毒的檢測限高達0.16～1.2μg/mL，而且由于該方法使用的抗體是兔抗蛇毒血清，所以在異源蛇毒間存在明顯的交叉反應。在進一步的臨床測試中，Chinonavanig又檢測了59份血清樣本和26份傷口拭子，結果顯示該方法對血清蛇毒的檢出率很低，僅僅只有52.5%，而且還有1例假陽性結果；對傷口拭子上蛇毒的檢出率更低，只有38.5%。雖然Chinonavanig的嘗試沒有獲得理想的結果，但是他奠定了凝集測試技術鑒定蛇毒的基礎。1993年，Kittigul等[14]進一步完善了這種技術，Kittigul用兔抗蛇毒血清活化的羊、雞和人的紅細胞作為檢測試劑，使用反向被動血凝法對泰國6種毒蛇的蛇毒進行了檢測，結果顯示該方法的檢測濃度下降到了2～635ng/mL，但在不同蛇毒間還是存在明顯的交叉反應。在檢測血清樣本時，Kittigul的檢測方法達到了81.3%的正確檢出率，但是在檢測傷口拭子樣本時，Kittigul的檢測方法卻只獲得了61.5%的正確檢出率。Kittigul的蛇毒鑒定方法在檢測濃度和正確檢測率這2項指標上相比于Chinonavanig的方法有了很大的提高，但是卻仍然存在正確檢出率偏低（81.3%）和交叉反應明顯的問題。1997年，哥斯達黎加的Amuy等[15]繼續對蛇毒凝集測試技術做出改進，他們嘗試用親和純化抗體來構建黑紋珊瑚蛇（Micrurus nigrocinctus）蛇毒的乳膠反向凝集方法，希望能夠實現蛇毒的種屬特異性鑒定，但是Amuy的方法在測試階段仍然對同屬的其他6種蛇毒顯示出了明顯的交叉反應。

凝集測試法應用于體內蛇毒鑒定雖然具有檢測時間短和操作簡便等優勢，但是Chinonavanig、Kittigul和Amuy課題組的研究卻都顯示出這種方法的正確檢出率低、檢測靈敏度不高，而且存在明顯的交叉反應，因此，就目前來看這種方法暫時還不適合應用于實際的蛇傷案件。雖然國外的研究一致顯示了凝集測試法的不足，但是在國內，個別醫院卻已經采用這種測試方法對臨床蛇傷進行鑒定[16]，并給出了相當正面的評價（約300例陽性鑒定結果中無1例出現交叉凝集抑制現象）。遺憾的是該醫院并沒有公布其凝集測試法的詳細細節，所以我們無法了解到該方法的關鍵技術。就國內外對凝集測試技術的研究和使用來看，該方法雖然存在種種有待解決的關鍵問題，但還是具有相當強的應用潛力的。

4.3 生物傳感器檢測法（biosensor assay）

生物傳感器是一種將生物學或仿生學信號感應部件連接或整合到傳感系統內的分析儀器，主要包括敏感元件和信號轉換元件兩部分。生物傳感器在使用過程中是通過固定在支持物上的敏感生物材料（即敏感元件）與分析物特異性結合，發生一種或多種物理化學特性的改變，然后由換能器轉換為次級可用信號（通常是電信號），這種信號的強弱或頻率的變化與敏感元件所結合的分析物或分析物化學基團相關，從而對待測物進行分析測定。

生物傳感器進入蛇毒鑒定領域是源于Rogers等[17]1991年的研究，他將煙堿型乙酰膽堿受體固定在光纖上制成生物傳感器，用以鑒定金環蛇蛇毒中的-銀環蛇毒素。Rogers的傳感器活性在最佳pH環境中可以保持3d，然后活性會逐漸降低，30d過后活性大致會損失50%。2005年，陶濤等[18]將生物傳感器鑒定蛇毒的技術做了改進，他將石英晶振的高靈敏度與免疫反應的特異性相結合，研制出了檢測蝮蛇毒的壓電免疫傳感器方法。但是在用純蛇毒對其性能進行測試時，陶濤的鑒定裝置在檢測濃度和交叉反應方面并沒有體現出特別的優勢，檢測限是0.1μg/mL，交叉反應也沒能避免，而且制備完成的鑒定裝置只能重復使用5次左右。繼Rogers和陶濤之后，生物傳感器鑒定蛇毒的研究鮮有報道。

生物傳感器鑒定蛇毒具有體積小和檢測時間短的優點，但是現階段的產品卻非常不成熟（僅處于對純蛇毒進行鑒定的階段），存在活性保持困難、重復使用次數少和交叉反應等問題，這嚴重限制了其在蛇毒鑒定領域的發展和應用，所以迄今未見生物傳感器應用于蛇傷實際鑒定工作的報道。但是生物傳感器畢竟具有便攜和檢測時間短的優點，如果其產品質量能夠獲得極大提升，那么還是具有應用價值的。

4.4 免疫學方法

4.4.1 放射免疫測定法（radio immunoassay，RIA）

放射免疫測定法是利用放射性同位素標記的抗原（標記抗原）和相對應的抗體來測定非標記抗原（標準抗原或待測抗原）的一種免疫測定方法。需要將標記抗原和非標記抗原同時與數量有限的特異性抗體發生競爭性結合（抗原-抗體反應）。由于標記抗原與待測抗原的免疫活性完全相同，對特異性抗體具有同樣的親和力，所以當標記抗原和抗體數量恒定且待測抗原和標記抗原的總量大于抗體上的有效結合點時，標記抗原-抗體復合物的形成將隨著待測抗原量的增加而減少，而非結合的或游離的標記抗原則隨著待測抗原數量的增加而增加（即競爭結合反應），因此測定標記抗原-抗體或游離的標記抗原即可推測出待測抗原的數量。

早在20世紀70年代，Sutherland等[19-20]就嘗試將RIA用于蛇傷診斷，并從蛇傷患者的尿液和血清中成功檢測到了相關毒素（Tiger snake毒素）。這是一次重要的研究，意味著現代醫學有能力對生物樣品中的蛇毒做出來源判斷。繼Sutherland的研究之后，1987年，Pukrittayakamee等[21]對RIA法的靈敏度和專屬性做了改進。Pukrittayakamee運用魯塞爾（Russell）蝰蛇蛇毒X因子的單克隆抗體構建用于檢測傷者體液中魯塞爾蝰蛇蛇毒的RIA方法。改進后的方法在靈敏度方面表現突出（檢測限在尿液中為4 ng/mL，在0.1%牛血清白蛋白-磷酸鹽緩沖液中為20 ng/mL，在血清中為5μg/mL），但是在交叉反應方面卻并不理想，由于抗體的特異性不夠，用該方法檢測眼鏡蛇蛇毒時也顯示陽性。

RIA法需要用到放射性同位素，在檢測完畢后對廢棄物的處理是非常麻煩的事情。到了20世紀90年代，隨著其他免疫學檢測技術的興盛（如：酶聯免疫吸附技術、熒光免疫技術等），RIA法用于蛇傷鑒定的研究日漸式微。直到1996年，英國的Sjostrom[22]等才開發出了另一種用于檢測血漿中極北蝰（Vipera berus berus）蛇毒的RIA方法，并且在測試過程中著重將這種方法與酶聯免疫吸附法（ELISA）進行了對比。在對比測試中，Sjostrom的RIA方法只表現出了與ELISA方法相似的檢測性能，并沒有獲得特別有吸引力的數據。這次的測試基本宣告了RIA退出蛇傷鑒定領域，在這之后的十幾年中，還未見有新文獻報道用RIA法來鑒定蛇傷。

4.4.2 免疫電泳檢測法（immunoelectrophoresis assay）

免疫電泳是將瓊脂電泳和雙向瓊脂擴散結合起來，用于分析抗原組成的一種定性方法。常規流程是先將抗原加到瓊脂板的小孔內進行電泳，然后在瓊脂板中央挖一橫槽，加入已知相應的免疫血清，兩者經一定時間相互擴散后，就會在抗原、抗體比例最適處形成沉淀弧。根據沉淀弧的數量、位置和外形，參照已知抗原、抗體形成的電泳圖，即可分析樣品中所含成分。此方法樣品用量少、特異性高、分辨力強。但所分析的物質必須有抗原性，而且抗血清必須含所有的抗體組分。

1990年，曹金鴻和李碧晴[23-24]用交叉免疫電泳法和逆流免疫電泳法對白眉蝮蛇毒、黑眉蝮蛇毒、五步蛇毒、竹葉青蛇毒和烙鐵頭蛇毒進行了鑒別研究，這是我國學者第一次用免疫電泳法對中國境內常見蛇毒開展系統研究，研究結果也表明這2種免疫電泳方法確實能夠區分不同種類的純蛇毒。但遺憾的是曹金鴻和李碧晴并沒有測試這2種電泳方法對生物樣品中蛇毒的辨別能力，所以這2種方法對蛇傷的實際鑒定能力仍不清楚。

火箭免疫電泳（rocket immunoelectrophoresis，RIEP）是將單向免疫擴散和電泳相結合的一種定量檢測技術。電泳時，存在于瓊脂凝膠中的抗體不發生移動，但在電場的作用下抗原會向正極泳動。當抗原與抗體分子達到適當比例時，形成一個形狀如火箭的不溶性免疫復合物沉淀峰，峰的高度與樣品中的抗原濃度呈正相關。因此，當瓊脂中抗體濃度固定時，根據樣品的沉淀峰長度即可計算出待測抗原的含量。1993年，廖共山等[25]用這種方法研究了商品眼鏡蛇毒抗血清與蛇毒成分產生的免疫沉淀線，發現眼鏡蛇的細胞毒與同科異種蛇毒的細胞毒之間不會發生交叉免疫反應。然而，廖共山也沒有用蛇毒生物樣品對他的方法進行測試，這使得RIEP方法對蛇傷的實際鑒定能力仍是未知數。

曹金鴻、李碧晴和廖共山將免疫電泳法帶入了蛇毒（體外檢材）鑒定領域，為蛇毒鑒定提供了新的思路，但是考慮到當前電泳技術的分離能力和生物樣品的復雜性，免疫電泳并不適合用于生物樣品中蛇毒的鑒定。

4.4.3 光學免疫檢測法（optical immunoassay，OIA）

光學免疫檢測法是使用光敏元件作為信號轉換器，利用光學原理工作的一種檢測方法。需要將生物識別物質固化在傳感器上，通過與光學器件的光相互作用，產生變化的光學信號，通過檢測變化的光學信號來檢測免疫反應。

2002年，新加坡國立大學的Dong等[26]將β-銀環蛇毒素單克隆抗體與硅晶片結合，并配備以親和素、生物素、辣根過氧化物酶顯色系統，開發了一種檢測蛇毒的光學免疫檢測方法（AB-OIA）。Dong等開發的蛇毒AB-OIA鑒定方法堪稱蛇傷鑒定技術的杰作，該方法完成一次蛇毒鑒定僅需25 min，檢測靈敏度達到了驚人的16pg/mL。交叉反應的測試數據顯示，該方法對于鋸鱗蝰屬蛇毒、死亡蛇屬蛇毒和其它9種蛇毒成分在1～5μg/mL的毒素濃度水平上未發現交叉反應。在用含毒生物樣品進行的測試中，Dong的ABOIA方法對正常組小鼠樣品全部呈現陰性，對注毒組小鼠樣品則全部呈現陽性。Dong的單克隆抗體ABOIA方法在檢測性能上表現搶眼，但是鑒于目前對蛇毒蛋白質的研究還不充分，我們并不知道哪些毒蛋白是某種蛇類特有的，因此該方法具體推廣起來有一定難度，但這并不影響該方法的價值，它是蛇傷鑒定技術的一次飛躍，將蛇毒鑒定的檢測限帶到了pg級。2004年，Dong等[27]又在原方法的基礎上做了改進，這次他們放棄使用單克隆抗體，改用親和純化方法制備的蛇毒種屬特異性抗體。Dong等將竹葉青蛇毒、孟加拉眼鏡蛇毒、眼鏡王蛇毒和紅口腹蛇毒的抗血清分別用其它3種蛇毒處理以除去抗血清中能夠發生交叉反應的抗體，然后用這4種抗血清建立了可用肉眼觀察鑒定結果的蛇毒光學免疫檢測方法（OIA）。該方法在毒素檢測濃度和交叉反應方面的性能與2002年的方法非常相似，在用全血、血漿、尿液、傷口分泌物、皰液和組織勻漿樣品開展的性能測試中表現優異。

蛇類的一次排毒量只有數毫克至一百多毫克，蛇毒進入人體后隨著人體體液的稀釋，濃度會急劇下降，因此鑒定方法的靈敏度對于鑒定能否成功至關重要。Dong等開發的光學免疫檢測方法在體內蛇毒測試中，不但在交叉反應方面表現優秀，而且擁有極低的檢測限，在蛇傷案件鑒定中無疑是具有重大應用價值的。4.4.4熒光免疫檢測法（fluorescence immunoassay）

熒光免疫檢測法是將熒光檢測與免疫檢測結合而成的一種免疫檢測方法，具有很高的檢測靈敏度。熒光免疫檢測法需要先將已知的抗原或抗體標記上熒光素，制成熒光抗體（或抗原），再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測組織或細胞內的相應抗原（或抗體）。在組織或細胞內形成的抗原抗體復合物上含有標記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受外來激發光的照射而發生明亮的熒光，從而確定抗原或抗體的含量。

1988年，Lomonte等[28]首次用鼠單克隆抗體建立了一種用于檢測粗鱗矛頭蝮（Bothrops asper）蛇毒的酶聯熒光免疫方法。這是非常重要的一次研究，它將熒光技術融入了蛇毒鑒定方法，還試圖用單克隆抗體消除免疫方法鑒定蛇毒長期存在的交叉反應問題，但是由于選擇的單克隆抗體不夠理想，Lomonte的方法被發現可以與墨西哥跳蝮（B.nummifer）蛇毒產生明顯的交叉反應。1993年，Bhatti等[29]也建立了用于檢測山蝰（Vipera russelli）蛇毒的酶聯熒光免疫法。相比于Lomonte的方法，Bhatti的方法在檢測靈敏度方面可謂進步巨大，由1.5 ng/mL下降到了0.1pg/mL。然而，Bhatti也沒能避免交叉反應，他選擇的抗體與蝰科（Viperinae）和蝮亞科（Crotalinae）的蛇毒間存在明顯的交叉反應。在Lomonte和Bhatti之后，新加坡的Gao[30]和美國的Gilliam[31]于2008年和2013年也分別建立了單珠熒光免疫法和熒光ELISA法用于蛇毒鑒定，但均未能克服交叉反應的影響。

熒光免疫檢測是一種非常靈敏的檢測技術，借助抗原-抗體結合的高特異性，對生物樣品中的蛇毒進行專屬鑒定也完全可行。但是，由于目前對蛇毒蛋白和蛇毒抗體的研究還不夠全面，自Lomonte以來，該方法均因為缺乏特異性足夠強的抗體與之相配套，而無法用于蛇傷實際案件的鑒定。

4.4.5 酶聯免疫吸附檢測法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）

ELISA方法的基本原理是利用酶分子與抗體或抗抗體分子共價結合形成酶標抗體，酶標抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發生特異性結合，滴加底物溶液后，底物可在酶作用下出現顏色反應，可以通過顏色反應是否出現來判定有無相應的免疫反應，而顏色的深淺是與標本中相應抗體或抗原的量呈正比的。在最近30年里，該方法在檢測性能方面獲得了長足進步。目前，ELISA方法已經成為蛇毒檢測最常用的免疫學方法。

ELISA方法用于蛇毒檢測是源于1977年Theakston[32]的一項研究。當時，Theakston和他的團隊嘗試將剛出現不久的ELISA新技術應用于臨床蛇傷的鑒定，在隨后的測試過程中，這種新方法表現出了令人滿意的靈敏度，檢測限可以達到1～5 ng/mL。這一次的嘗試是ELISA法應用于蛇傷鑒定的開始，圍繞ELISA方法的下一個重要發現來自于1981年Gopalakrishnakone[33]的研究。為了弄清蛇毒抗血清的特異性，Gopalakrishnakone等用南美響尾蛇（Crotalus durissus terrificus）的抗血清建立了ELISA流程來研究與多種蛇毒磷酸酯酶A2的反應。這項研究第一次揭示了蛇毒蛋白質成分的相似是免疫學方法鑒定蛇毒時交叉反應產生的基礎，為交叉反應的克服提供了理論基礎。

交叉反應的存在對于蛇傷臨床治療是有利的，但是對于蛇傷的準確鑒定卻是非常不利的[34]。為了克服免疫學方法鑒定蛇傷時存在的交叉反應，以Barral-Netto為首的一些學者開始嘗試制備蛇毒中單一組分的多克隆抗體并將其用于蛇毒鑒定。Barral-Netto等[35]從南美響尾蛇（Crotalus durissus terrificus）蛇毒中純化出了單一毒素成分：響尾蛇毒素（crotoxin），并制備了這種毒素的多克隆抗體。利用這種抗體建立的ELISA方法其交叉反應強度明顯降低，只是當其它毒素的濃度達到1μg/mL時才出現交叉反應，可以說是ELISA法鑒定蛇毒的一次重大突破。1994年，Li等[36]運用與Barral-Netto相似的方法建立了寬帶銅斑蛇（Agkistrodon contortrix laticintus）蛇毒的鑒定方法，同樣獲得了不錯的檢測性能。測試結果顯示，該方法對蝮蛇屬（Agkistrodon species）的其它蛇毒沒有明顯的交叉反應，僅對矛頭蝮屬（Bothrops species）的2種蛇毒存在明顯的交叉反應。

蛇毒單一毒素多克隆抗體的應用大大降低了ELISA法鑒定蛇毒時的交叉反應，但是交叉反應在一定范圍內仍然存在并繼續困擾著低濃度蛇毒樣品的鑒定。為了進一步克服交叉反應，一些學者開始將單一毒素的單克隆抗體引入蛇毒ELISA鑒定方法。在這個方向上的第1次嘗試是由瑞典的Amuy團隊完成的。1997年，Amuy等[37]制備了中美珊瑚蛇（Micrurus nigrocinctus）蛇毒的單克隆抗體并將其與多克隆抗體進行了對比測試，使用單克隆抗體的ELISA方法表現出了更低的交叉反應強度。在這之后，巴西的Fernandes[38]于 2010年再次用三色矛頭蝮（Bothrops asper）蛇毒金屬蛋白酶BaP1的單克隆抗體研究ELISA鑒定蛇毒的交叉反應，同樣獲得了令人滿意的結果。Fernandes在研究中用了27種異種蛇毒做交叉反應測試，這是迄今為止最為全面的一次測試，測試結果再次證明了蛇毒單克隆抗體可以有效降低交叉反應的發生。

在Amuy和Fernandes做蛇毒單克隆抗體研究的同時，另一些學者卻在嘗試采用經親和純化的多克隆抗體來鑒定蛇毒。其原理是將異種蛇毒包被在經活化的色譜載體上，讓目標蛇毒的抗血清流經色譜柱，收集流出液即為蛇毒種屬特異性抗體，然后用這種抗體來構建ELISA鑒定方法。在目前對蛇毒蛋白質認識不足、特異性單克隆抗體很少的情況下，這種方法具有很高的實用價值。自20世紀90年代以來，很多學者采用這種抗體開展的體內外蛇毒研究結果也證實了蛇毒種屬特異性抗體擁有優異的檢測特異性[39-44]。

在檢測靈敏度方面，隨著生物素-親和素（Biotin-Avidin，BA）放大系統被引入到 ELISA方法中[45-46]，目前的ELISA法鑒定蛇毒的靈敏度已經達到了pg級。

就生物樣品中蛇毒鑒定的靈敏度、特異性以及鑒定方法實施的難易程度來看，ELISA法是目前蛇毒免疫學鑒定方法中的最佳選擇。

4.5 質譜法（Mass Spectrometry，MS）

20世紀80年代，隨著電噴霧離子化（Electrospray Ionization，ESI）技術和基質輔助激光解析離子化（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization，MALDI）技術的出現，用質譜分析蛋白質成為了可能。質譜法鑒定蛋白質的原理是運用不同離子化方法將樣品中的組分解離為氣相離子后，根據不同離子質荷比（m/z）的差異進行分離，從而鑒定蛋白質。因為質譜法具有高通量、高靈敏度、可自動化等優點，所以在蛋白質鑒定領域迅速擴展。近十年來，質譜技術也頻頻出現在蛇毒蛋白的研究領域。

4.5.1 基質輔助激光解析離子化質譜法（MALDI-MS）

基質輔助激光解析離子化是用基質包裹樣品分子，在激光照射下，基質氣化將樣品分子釋放到氣相中的技術。這是一項軟電離技術，非常適合生物大分子的電離。

2003年，英國的Creer等[47]用基質輔助激光解析飛行時間質譜法（MALDI-TOF-MS）研究了臺灣及周邊島嶼蝮蛇（pit viper）蛇毒的種間變異。他們從蛇毒中鑒定到了大量蛋白質，從中尋找到了7種不同的磷酸酯酶A2（PLA2）及異構體，邁出了MALDI-MS鑒定蛇毒蛋白質精細差異的第一步，也證明了MALDI-MS有能力區分不同種類的蛇毒。同年，臺灣的Nawarak等[48]也用多維色譜技術結合MALDI-MS研究了眼鏡蛇科（Elapidae）和蝰科（Viperidae）共 10 種蛇毒在蛋白質組成方面的差異（種內差異、種間差異和科間差異）。在這項研究中，Nawarak共鑒定到了133種蛋白質，從中篩選出了各種蛇毒特有的蛋白質，這是第一次用MALDI-MS對蛇毒蛋白進行大規模的橫向比較。但是Nawarak的研究也暴露出了多維色譜技術結合MALDI-MS檢測蛋白質的缺點：獲得的數據量偏小。

Creer和Nawarak的研究為MALDI-MS在蛇毒蛋白質組學研究中的應用打下了堅實的基礎，此后，很多研究人員陸續用類似的方法對各種蛇毒開展了與蛇毒進化、蛇種歸屬和蛇類發育等相關的研究[49-54]，獲得了豐富的數據，極大的推進了MALDI-MS在蛇毒蛋白質組學中的應用。

4.5.2 電噴霧離子化質譜法（ESI-MS）

電噴霧離子化是一種在大氣壓下實現電離的技術，其原理是利用毛細管和質譜儀進口間的電勢差生成離子，在電場作用下產生以噴霧形式存在的帶電液滴，當使用干燥氣加熱時，溶劑蒸發，液體體積縮小，最終生成去溶劑化離子。電噴霧電離的特點是可以生成高度帶電的離子而不發生碎裂，可以極大的降低質荷比，非常適合于檢測生物大分子。

2002年，澳大利亞的Fry等[55]用高效液相色譜（HPLC）結合ESI-MS技術研究了澳大利亞4種死蝰（death adder）的蛇毒蛋白，發現這4種蛇毒組分最明顯的特點是多樣化，研究結果對于確定死蝰的分類地位和系統學關系很有幫助。2003年，Fry等[56]繼續用HPLC結合ESI-MS技術研究蝰蛇（5種）、眼鏡蛇（15種）和有毒游蛇（22種）的毒液蛋白，這是迄今為止最大規模的蛇毒蛋白質組學研究。在這項研究中，Fry等發現不同的蛇毒在蛋白質組成上差異明顯，他們還在游蛇科蛇毒中發現了一些常見于眼鏡蛇科和蝰蛇科的毒素蛋白（3指毒素和富含半胱氨酸的分泌蛋白），這些發現對于蛇毒鑒定和蛇傷鑒定都有著重要意義。

Fry課題組的研究對于ESI-MS用于蛇毒蛋白質檢測是具有里程碑意義的，在這之后，涌現出了大量用ESI-MS研究蛇毒蛋白質的文獻[57-61]。為了進一步追求蛇毒蛋白質鑒定的數量，也有一些課題組將ESI-MS和MALDI-MS方法結合起來研究蛇毒[62-67]，但是，遺憾的是這些研究普遍都只著眼于純蛇毒的蛋白質鑒定，而沒有開展生物樣品中蛇毒蛋白質的研究，也沒有關注蛇毒中毒生物體內生物標記物的發現。這一狀況直到2011年才由哥斯達黎加的Rucavado[68]打破。Rucavado給小鼠注射Bothrops asper蛇的蛇毒，然后收集傷口分泌物，用LC-MS對分泌物中的內源蛋白質進行鑒定，共鑒定到340個內源蛋白質，主要包括細胞內蛋白、血漿蛋白、細胞外基質蛋白和細胞膜相關蛋白，這些蛋白質的出現表明Bothrops asper蛇毒可以造成細胞破壞、胞漿滲出、細胞外基質降解和膜蛋白脫落，其中一些蛋白質甚至有可能成為Bothrops asper蛇毒導致的心肌壞死和微血管損傷的生物標記物。Rucavado的研究對于蛇傷鑒定意義重大，該研究將目標首次瞄向了生物標記物，為蛇傷鑒定指出了新的方向。繼Rucavado之后，巴西的Paes Leme[69]也開展了重要的研究工作，他用LC-MS/MS研究了蛇毒基質金屬蛋白酶（HF3，來自于Bothrops jararaca蛇毒）的出血活性，率先將蛇毒單一毒素與中毒動物內源蛋白質的變化聯系了起來。Paes Leme將HF3分別注入小鼠背部皮下和腿部肌肉，然后收集背部皮膚和血漿，與對照組相比分析其中的差異蛋白質。在這項研究中，細胞外基質、細胞溶質、細胞骨架和胞漿蛋白被發現在中毒皮膚中降解明顯，而在血漿中降解最明顯的則是纖連蛋白。Rucavado和Paes Leme開辟了蛇傷研究的新領域，這對于蛇傷鑒定和蛇傷治療都具有重要意義。

質譜法用于蛇毒研究在近十年來獲得了快速發展，積累了大量的蛋白質數據和研究經驗，這為蛇毒中毒機理的深入研究提供了新的舞臺，也為蛇傷鑒定做了新的鋪墊。未來，這一領域將是蛇傷研究的重點領域之一。

5 問題與展望

蛇毒蛋白是蛇毒的毒性成分，不同蛇類其毒素蛋白質的組成是不同的，在某種意義上，蛇傷鑒定也就是鑒定生物樣品中的蛇毒蛋白質，從而對肇事蛇種做出推斷。根據當前的數據，全世界的毒蛇約650余種，分別屬于前溝牙類毒蛇、后溝牙類毒蛇和管牙類毒蛇，但已經開展蛇毒蛋白質組學研究的毒蛇僅有100多種，這表明我們對蛇毒蛋白所知甚少，將大大影響蛇毒鑒定的準確性。因此，建立詳細而全面的蛇毒蛋白質數據庫，解決蛇毒蛋白質研究中的生物信息學瓶頸，可能仍是未來很長一段時間內的研究重點。

在目前階段，免疫學方法是鑒定蛋白質的主要手段，因此其也順理成章成為生物樣品中蛇毒蛋白鑒定的主要研究方向，并獲得了很大進展。但縱觀早期的蛇傷免疫學鑒定方法，我們可以看到存在大量蛋白間的交叉反應，以至于很多方法只是停留在實驗室研究階段，并沒有進入臨床應用。近期的蛇傷免疫鑒定方法主要是應用經免疫親和柱純化的抗血清或經嚴密篩選的單克隆抗體來實施的，這2種方法在原理上是可以避免鑒定中的交叉反應，為蛇傷鑒定帶來準確結果的，但是，這2種方法在蛇傷鑒定研究中起步較晚，至今也只有極少數商品化蛇毒鑒定試劑盒供應。免疫法鑒定蛇傷雖然還存在一些需要解決的關鍵問題（主要是特異性抗體的篩選），但其發展前景無疑是非常光明的，其所具有的高靈敏度和快速響應等優點非常適合臨床應用。未來，在解決了抗體特異性的問題以后，免疫法鑒定蛇傷可能被臨床廣泛接受。

另一個有發展前景的鑒定方法是質譜法，但該方法起步較晚，相對于免疫方法其基礎薄弱、數據積累少，而且目前的質譜法鑒定蛋白質存在耗時過長和儀器操作過于復雜的缺點，還不適宜臨床大規模應用。但值得注意的是，近10年來生物大分子質譜鑒定技術的快速發展和儀器的快速改良向我們展示了它的潛力，而且質譜技術一次可以鑒定上千個蛋白質，讓我們可以用蛋白質群來對蛇毒做出歸屬，這對于提高鑒定準確性非常有利，無疑是非常有吸引力的。隨著質譜鑒定蛋白質流程的快速化、儀器的簡單化，質譜法也必將在蛇傷鑒定中發揮重要作用。

[1]de Silva HJ，Kasturiratne A，Pathmeswaran A，etal.Snakebite：the true disease burden has yet to be determined[J].Ceylon Med J， 2013， 58（3）：93-95.

[2]Gutiérrez JM， Warrell DA， Williams DJ， etal.Global Snakebite Initiative.The need for full integration of snakebite envenoming within a global strategy to combat the neglected tropical diseases： the way forward[J].PLoSNegl Trop Dis.2013，7（6）：e2162.

[3]龔旭初，楊萬富.國內毒蛇咬傷流行病學研究現狀[J].中國中醫急癥，2012，21（5）： 778-780.

[4]藍海.中國毒蛇及蛇傷救治.第二屆全國中毒急危重癥學術研討會暨泰山中毒與職業病高峰論壇文集[C].2011：42-46.

[5]陳坤，鄧立普.蛇毒與急性肺損傷的研究進展[J].蛇志，2010，22（3）： 255-257.

[6]Calvete JJ， Escolano J， Sanz L.Snake venomics of Bitis species reveals large intragenus venom toxin composition variation：application to taxonomy of congeneric taxa[J].J Proteome Res， 2007，6（7）： 2732-2745.

[7]邵敏貞，鄭穎，葉鋒平，等.-銀環蛇毒素和-銀環蛇毒素的研究進展[J].蛇志，2010，22（2）： 132-136.

[8]陳世德，李其斌.毒蛇咬傷救治的幾點認識[J].蛇志.2009，21（2）： 125-127.

[9]林文珍，舒雨雁，周元聰.蛇毒磷脂酶A2的研究[J].現代臨床醫學生物工程學雜志，2002，8（6）： 397-402.

[10]辛淑波，陳家樹.蛇毒凝血組分促凝機制及其應用研究進展[J].蛇志，2006，18（4）： 291-295.

[11]寧宗，李志芳，李其斌.出血性蛇毒對凝血功能影響的研究進展[J].蛇志，2011，23（4）： 368-369.

[12]Suntrarachun S，Pakmanee N，Tirawatnapong T，etal.Development of a polymerase chain reaction to distinguish monocellate cobra （Naja khouthia） bites from other common Thai snake species，using both venom extracts and bite-site swabs[J].Toxicon， 2001，39（7）：1087-1090.

[13]Chinonavanig L， Karnchanachetanee C， Pongsettakul P， etal.Diagnosis of snake venoms by a reverse latex agglutination test[J].JToxicol Clin Toxicol， 1991，29（4）：493-503.

[14]Kittigul L，Ratanabanangkoon K.Reverse passive hemagglutination tests for rapid diagnosis of snake envenomation[J].J Immunoassay， 1993，14（3）：105-127.

[15]Amuy E， Alape-Girón A， Lomonte B， etal.Development of immunoassays for determination of circulating venom antigens during envenomations by coral snakes （Micrurus species） [J].Toxicon， 1997，35（11）：1605-1616.

[16]陳康德，羊梅蘭.乳膠凝集抑制試驗快速診斷致傷蛇種的臨床應用[J].中華醫學檢驗雜志，1998，21（4）：227-229.

[17]Rogers KR， Valdes JJ， Eldefrawi ME.Effects of receptor concentration，media pH and storage on nicotinic receptortransmitted signal in a fiber-optic biosensor[J].Biosens Bioelectron， 1991，6（1）：1-8.

[18]陶濤，鐘滿森，余連德.檢測腹蛇毒的壓電免疫傳感器的研究[J].上海生物醫學工程，2005，26（4）：232-235.

[19]Sutherland SK，Coulter AR.Snake bite：detection of venom by radioimmunoassay[J].Med JAust， 1977，2（20）：683-684.

[20]Sutherland SK，Coulter AR.Three instructive cases of tiger snake （Notechis scutatus） envenomation--and how a radioimmunoassay proved the diagnosis[J].Med JAust， 1977，2（6）：177-180.

[21]Pukrittayakamee S， Ratcliffe PJ， McMichael AJ， etal.A competitive radioimmunoassay using a monoclonal antibody to detect the factor X activator of Russell's viper venom[J].Toxicon， 1987，25（7）：721-729.

[22]Sjostrom L，Karlson-Stiber C，Persson H，etal.Development and clinical application of immunoassays for European adder （Vipera berus berus） venom and antivenom[J].Toxicon，1996，34（1）：91-98.

[23]曹金鴻，李碧晴.交叉免疫電泳法鑒定蛇毒的研究[J].上海免疫學雜志， 1990，10（8）：177-179.

[24]李碧晴，曹金鴻.逆流免疫電泳法檢測蛇毒[J].中國免疫學雜志，1990，（5）：317.

[25]廖共山，林柏溪，黃湘萍.酶標抗原火箭免疫電泳法及其在蛇毒抗原成分含量測定中的應用[J].蛇志，1993，5（2）：10-14.

[26]Dong le V，Selvanayagam ZE，Gopalakrishnakone P，etal.A new avidin-biotin optical immunoassay for the detection of beta-bungarotoxin and application in diagnosis of experimental snake envenomation[J].J Immunol Methods， 2002，260（1-2）：125-136.

[27]Dong le V，Eng KH，Quyen le K，etal.Optical immunoassay for snake venom detection[J].Biosens Bioelectron，2004，19（10）：1285-1294.

[28]Lomonte B，Kahan L.Production and partial characterization of monoclonal antibodies to Bothrops asper （terciopelo） myotoxin[J].Toxicon， 1988，26（7）：675-689.

[29]Bhatti AR，Wong JP，Siddiqui YM，etal.A sensitive fluorogenic enzyme linked immunosorbent assay for the detection of Vipera russelli venom[J].Nat Toxins， 1993，1（5）：277-282.

[30]Gao R，Zhang Y，Gopalakrishnakone P.Single-bead-based immunofluorescence assay for snake venom detection[J].Biotechnol Prog， 2008，24（1）：245-249.

[31]Gilliam LL，Ownby CL，McFarlane D，etal.Development of a double sandwich fluorescent ELISA to detect rattlesnake venom in biological samples from horses with a clinical diagnosis of rattlesnake bite[J].Toxicon， 2013，73：63-68.

[32]Theakston RD，Lloyd-Jones MJ，Reid HA.Micro-ELISA for detecting and assaying snake venom and venom-antibody[J].Lancet， 1977，2（8039）：639-641.

[33]Gopalakrishnakone P， Hawgood BJ， Theakston RD.Specificity of antibodies to the reconstituted crotoxin complex，from the venom of South American rattlesnake（Crotalus durissus terrificus）， using enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） and doubleimmunodiffusion[J].Toxicon， 1981，19（1）：131-139.

[34]Ho M，Warrell MJ，Warrell DA，etal.A critical reappraisal of the use of enzyme-linked immunosorbent assays in the study of snake bite[J].Toxicon， 1986，24（3）：211-221.

[35]Barral-Netto M，von Sohsten RL.Serum kinetics of crotoxin from Crotalus durissus terrificus venom in mice：evidence for a rapid clearance[J].Toxicon， 1991，29（4-5）：527-531.

[36]Li Q，Ownby CL.Development of an enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） for identification of venoms from snakes in the Agkistrodon genus[J].Toxicon， 1994，32（11）：1315-1325.

[37]Amuy E， Alape-Girón A， Lomonte B， etal.Development of immunoassays for determination of circulating venom antigens during envenomations by coral snakes（Micrurus species）[J].Toxicon， 1997，35（11）：1605-1616.

[38]Fernandes I， Assumpcao GG， Silveira CR， etal.Immunochemical and biological characterization of monoclonal antibodies against BaP1，a metalloproteinase from Bothrops asper snake venom[J].Toxicon， 2010，56（6）：1059-1065.

[39]Heneine LG，Catty D，Theakston RD.Development of a species-specific ELISA for Brazilian pit-viper venoms[J].Braz JMed Biol Res， 1990，23（6-7）：585-588.

[40]Heneine LG，Catty D.Species-specific detection of venom antigens from snakes of the Bothrops and Lachesis genera[J].Toxicon， 1993，31（5）：591-603.

[41]Chavez-Olortegui C，Lopes CS，Cordeiro FD，etal.An enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） that discriminates between Bothrops atrox and Lachesis muta muta venoms[J].Toxicon， 1993，31（4）：417-425.

[42]Chávez-Olórtegui C， Penaforte CL， Silva RR， etal.An en-zyme-linked immunosorbent assay （ELISA） that discriminates between the venoms of Brazilian Bothrops species and Crotalus durissus[J].Toxicon， 1997，35（2）：253-260.

[43]Van Dong L，Quyen le K，Eng KH，etal.Immunogenicity of venoms from four common snakes in the South of Vietnam and development of ELISA kit for venom detection[J].J Immunol Methods， 2003，282（1-2）：13-31.

[44]Gao JF， Wang J， Qu YF， etal.Immunoreactivity between venoms and commercial antiserums in four Chinese snakes and venom identification by species-specific antibody[J].J Immunol Methods， 2013，387（1-2）：211-218.

[45]郭慕平，王晴川，劉廣芬.眼鏡蛇毒細胞毒素的生物素-抗生物素蛋白-酶聯免疫吸附檢測[J].中國藥理學報，1992，13（2）：189-192.

[46]Kulawickrama S，O'Leary MA，Hodgson WC，etal.Development of a sensitive enzyme immunoassay for measuring taipan venomin serum[J].Toxicon， 2010，55（8）：1510-1518.

[47]Creer S，Malhotra A，Thorpe RS，etal.Genetic and ecological correlates of intraspecific variation in pitviper venom composition detected using matrix-assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometry （MALDI-TOF-MS） and isoelectric focusing[J].JMol Evol， 2003，56（3）：317-329.

[48]Nawarak J， Sinchaikul S， Wu CY， etal.Proteomics of snake venoms from Elapidae and Viperidae families by multidimensional chromatographic methods[J].Electrophoresis，2003，24（16）：2838-2854.

[49]Birrell GW， Earl ST， Wallis TP， etal.The diversity of bioactive proteins in Australian snake venoms[J].Mol Cell Proteomics， 2007，6（6）：973-986.

[50]Sanz L，Ayvazyan N，Calvete JJ.Snake venomics of the Armenian mountain vipers Macrovipera lebetina obtusa and Vipera raddei[J].JProteomics， 2008，71（2）：198-209.

[51]Alape-Girón A， Sanz L， Escolano J， etal.Snake venomics of thelancehead pitviper Bothropsasper： geographic， individual， and ontogenetic variations[J].J Proteome Res， 2008，7（8）：3556-3571.

[52]Lomonte B， Escolano J， Fernández J， etal.Snake venomics and antivenomics of the arboreal neotropical pitvipers Bothriechis lateralis and Bothriechis schlegelii[J].JProteome Res，2008， 7（6）：2445-2457.

[53]Angulo Y，Escolano J，Lomonte B，etal.Snake venomics of Central American pitvipers：clues for rationalizing the distinct envenomation profiles of Atropoides nummifer and Atropoides picadoi[J].JProteome Res， 2008， 7（2）：708-719.

[54]Igci N，Demiralp DO.A preliminary investigation into the venom proteome of Macrovipera lebetina obtusa（Dwigubsky， 1832） from Southeastern Anatolia by MALDI-TOF mass spectrometry and comparison of venom protein profiles with Macrovipera lebetina lebetina （Linnaeus， 1758） from Cyprusby 2D-PAGE[J].Arch Toxicol， 2012，86（3）：441-451.

[55]Fry BG，Wickramaratna JC，Hodgson WC，etal.Electrospray liquid chromatography/mass spectrometry fingerprinting of Acanthophis （death adder） venoms： taxonomic and toxinological implications[J].Rapid Commun Mass Spectrom，2002， 16（6）：600-608.

[56]Fry BG，Wüster W，Ryan Ramjan SF，etal.Analysis of Colubroidea snake venoms by liquid chromatography with massspectrometry：evolutionary and toxinological implications[J].Rapid Commun Mass Spectrom， 2003，17（18）：2047-2062.

[57]Serrano SM，Shannon JD，Wang D，etal.A multifaceted analysis of viperid snake venoms by two-dimensional gel electrophoresis：an approach to understanding venom proteomics[J].Proteomics， 2005， 5（2）：501-510.

[58]Fox JW，Ma L，Nelson K，etal.Comparison of indirect and direct approaches using ion-trap and Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry for exploring viperid venom proteomes[J].Toxicon， 2006， 47（6）：700-714.

[59]Georgieva D，Risch M，Kardas A，etal.Comparative analysis of the venom proteomes of Vipera ammodytes ammodytes and Vipera ammodytesmeridionalis[J].JProteome Res， 2008，7（3）：866-886.

[60]Calvete JJ，Ghezellou P，Paiva O，etal.Snake venomics of two poorly known Hydrophiinae：Comparative proteomics of the venoms of terrestrial Toxicocalamus longissimus and marine Hydrophis cyanocinctus[J].JProteomics， 2012，75（13）：4091-4101.

[61]Coutinho-Neto A，Caldeira CA，Souza GH，etal.ESI-MS/MS identification of a bradykinin-potentiating peptide from Amazon Bothrops atrox snake venom using a hybrid QqoaTOF mass spectrometer[J].Toxins（Basel）， 2013， 5（2）：327-335.

[62]Juárez P， Sanz L， Calvete JJ.Snake venomics： characterization of protein families in Sistrurus barbouri venom by cysteine mapping， N-terminal sequencing， and tandem mass spectrometry analysis[J].Proteomics， 2004， 4（2）：327-338.

[63]Li S， Wang J， Zhang X， etal.Proteomic characterization of two snake venoms：Naja naja atra and Agkistrodon halys[J].Biochem J， 2004， 384（Pt 1）：119-127.

[64]Bazaa A，Marrakchi N，El Ayeb M，etal.Snake venomics：comparative analysis of the venom proteomes of the Tunisian snakes Cerastes cerastes，Cerastes vipera and Macrovipera lebetina[J].Proteomics， 2005，5（16）：4223-4235.

[65]Calvete JJ， Marcinkiewicz C， Sanz L.Snake venomics of Bitis gabonica gabonica.Protein family composition，subunit organization of venom toxins，and characterization of dimeric disintegrins bitisgabonin-1 and bitisgabonin-2[J].JProteome Res， 2007，6（1）：326-336.

[66]Munawar A，Trusch M，Georgieva D，etal.Venom peptide analysis of Vipera ammodytes meridionalis （Viperinae） and Bothrops jararacussu （Crotalinae） demonstrates subfamilyspecificity of the peptidome in the family Viperidae[J].Mol Biosyst， 2011，7（12）：3298-3307.

[67]Tashima AK，Zelanis A，Kitano ES，etal.Peptidomics of three Bothrops snake venoms：insights into the molecular diversification of proteomes and peptidomes[J].Mol Cell Proteomics， 2012， 11（11）：1245-1262.

[68]Rucavado A1， Escalante T， Shannon J， etal.Proteomics of wound exudate in snake venom-induced pathology：search for biomarkers to assess tissue damage and therapeutic success[J].JProteome Res， 2011， 10（4）：1987-2005.

[69]Paes Leme AF1，Sherman NE，Smalley DM，etal.Hemorrhagic activity of HF3， a snake venom metalloproteinase：insights from the proteomic analysis of mouse skin and blood plasma[J].JProteome Res， 2012， 11（1）：279-291.