肺結核患者痰標本分枝桿菌培養方法分析

閆曉琳

肺結核是結核分枝桿菌引起的肺部慢性傳染性疾病。結核菌屬分枝桿菌屬, 對人類致病主要是人型菌, 其次為牛型菌, 具有抗酸染色的特性。結核菌素試驗是判斷機體是否感染過結核分枝桿菌的主要手段, 結核菌素強陽性反應提示機體處于結核超敏感狀態［1］。選取2012年6月～2013年6月60例肺結核患者痰標本進行快速培養系統檢測提高結核分枝桿菌的檢出率。

1 材料與方法

1.1 標本來源 肺結核患者60例痰標本均來自本院住院患者。其中男38例, 女22例, 年齡8～83歲, 平均34歲。

1.2 痰標本前處理 ①酸處理法：用于堿性L-J培養基。取痰標本數毫升, 根據黏稠度的不同, 加入2～4倍量的2%～4%H2SO4, 振蕩, 混勻, 放室溫處理20 min, 其間振蕩2～3次, 促進液化。②堿處理法：用于酸性L-J培養基。取痰標本數毫升, 根據黏稠度的不同, 加入2～4倍量2%～4%NaOH, 振蕩器振蕩5～10 min或置室溫30 min, 其間振蕩2～3次促進液化。③胰蛋白酶、新潔爾滅法：痰標本加入等量或倍量0.1%胰蛋白酶溶液, 振蕩至消化均勻, 加入半量以殺滅雜菌的0.3%新潔爾滅, 混勻放置室溫5 min。注意新潔爾滅與標本接觸勿超過5 min。④NaOHNALC法：試劑配置：2.94%(0.1 mol/L)枸櫞酸鈉溶液50 ml, 加4%NaOH溶液50 ml, 混勻, 臨用前加入0.5 g NALC, 因該溶液不穩定, 應密閉冷藏且當日內使用。處理方法：取痰標本1 ml放入50 ml離心管內, 加等量消化液, 振蕩混勻, 靜置20 min。加滅菌的濃度為0.067 mol/L的pH 6.8磷酸鹽緩沖液至50 ml刻度處混勻, 3000 r/min, 離心20 min, 棄去上清。

1.3 接種 將培養基置溫箱預溫30 min(羅氏培養基或其他固體結核培養基)。于無菌室內用毛細管取標本約0.1 ml, 接種于培養基斜面, 使其沿斜面鋪蓋。封嚴管口, 將試管平置, 使斜面呈水平位15～20 min, 移入37℃培養, 如采用4%NaOH處理則應用硫酸中和后接種。

1.4 結果觀察 培養基接種標本以后, 每周由溫箱觀察1次, 有菌落生長時, 可報告。分枝桿菌培養陰性(-)斜面無菌生長, 分枝桿菌培養陽性(+)菌落占斜面面積的1/4, 分枝桿菌培養陽性(++)菌落占斜面面積的1/2, 分枝桿菌培養陽性(+++)菌落占斜面面積的3/4, 分枝桿菌培養陽性(++++)菌落布滿全斜面, 菌落占斜面面積不足1/4者實報菌落數。必要時做涂片染色, 生化鑒定、菌型鑒定、動物實驗等。至第8周未生長時可報告“培養8周無結核分枝桿菌生長”。在觀察分枝桿菌生長情況時, 發現有非分枝桿菌的生長,報告污染, 重新送檢。

2 結果

痰涂片抗酸染色鏡檢, 陽性23例, 陽性率38.33%。

3 討論

分枝桿菌的培養和一般細菌不同, 營養要求比較高, 如需要氧、碳、氮、氨基酸、無機鹽類(磷、鉀、鎂、鐵等)、生長素(煙酸、核黃素及來自卵黃、血液的某些成分)等。常用的培養基用氨基酸、甘油及無機鹽等成分配制基礎液, 再加雞蛋液混勻凝固而形成固體培養基。分枝桿菌培養的目的是增加分枝桿菌生長率, 提高陽性率, 為結核病的診斷提供最可靠的證據；活菌可用于藥物敏感性測定, 指導臨床藥物治療；活菌可用于菌種鑒定, 為結核病與非結核性分枝桿菌病鑒別診斷提供依據；活菌可用于毒力測定；用于流行病學調查, 明確傳染源, 確定預防措施［2］；某些通過檢測細菌生長早期代謝物達到快速鑒定細菌目的的新方法仍屬培養范疇。

標本前處理是利用分枝桿菌細胞壁的高脂質成分具有較強抗酸、堿作用的特性, 在培養接種前將標本用強酸或強堿加以處理, 其目的是殺滅或抑制雜菌的生長, 溶解黏液、膿汁、蛋白, 將被包裹的分枝桿菌釋放出來, 提高檢出率。

培養基一般放冰箱(2～8℃)避光保存。為了防止培養基失去凝固水, 可采用螺旋試管分裝培養基, 并將試管裝入塑料袋中封口保存。必要時對培養基進行抽樣生長試驗, 接種標準菌株(H3TRy)10-3mg濕菌, 4周內有菌落生長者方可, 否則為質量不合格。污染率應控制在2%以下, 當污染率高于2%時, 提示培養基污染或消化處理不當。應采取相應措施。

［1］ 劉志輝, 羅魯.結核病實驗室診斷現狀及展望.中國防癆雜志, 2003,25(3):38-40.

［2］ 張衛紅, 石勝, 黃小霞, 等.綜合醫院與結核病防治所痰涂片抗酸桿菌檢出率比較.中國基層醫學, 2004,11(6):700.