不同形式的HIV DNA與疾病進展的相關性分析

姜太一，李紅艷，張 彤，吳 昊，焦艷梅

HIV 感染過程中，HIV RNA 基因反轉錄為病毒DNA，線狀的雙鏈HIV DNA 以整合前復合物的形式轉到細胞核內。然后，在宿主整合酶的作用下，一些線狀的雙鏈HIV DNA 隨機整合到宿主細胞基因組內。也有一些線狀的HIV DNA 未整合進宿主內，在線粒體外形成1 個長末端重復序列（long terminalrepeat,LTR）和2 個LTR 的環狀HIVDNA[1-2]。對于環狀HIV DNA 是否能夠長期穩定存在目前尚有爭議。

HIV RNA 定量是目前評價HIV 感染疾病進展的重要指標，在臨床上被廣泛應用。據文獻報道，在HIV 感染早期，外周血中HIV DNA 的水平也可作為預測疾病進展的重要指標[3-5]。這些研究進一步說明研究急性期HIV DNA 水平與疾病進展的相關性，有利于進一步揭示HIV 的致病機制。雖然有研究證實HIV DNA 與疾病進展密切相關，但哪種形式的HIV DNA 與疾病進展關系最密切目前尚無報道。本研究旨在探討不同形式的HIV DNA 的動力學變化特點及其與疾病進展的關系。

1 對象與方法

1.1 對象 選擇2006年1月—2012年12月首都醫科大學附屬北京佑安醫院規律隨診的男同性戀HIV/AIDS 患者，診斷標準參照《艾滋病診療指南（2011 版）》[6]，所有病例均經蛋白印跡試驗確證為HIV 感染。共入組48例，均未接受過抗病毒治療。根據Fiebig 分期評估患者的感染時間[7]，并按照評估的感染時間，將患者分為≤60 d 組、60～90 d 組和90～365 d 3 組。本研究方案經本院倫理委員會批準，所有受試者均于采血前簽署知情同意書。患者一般情況見表1。

1.2 外周全血DNA 提取 采用德國Qiagen 公司生產的DNA 提取試劑盒提取外周血中的DNA，具體操作方法參照試劑盒說明書。

1.3 實時定量PCR 檢測 采用ABI7900 實時定量儀（美國應用生物系統公司）、改良型RPMI-1640培養基（HyClone 公司，美國）、聚蔗糖-泛影葡胺分層液（淋巴細胞分離液，Ficoll，天津）和DNA 提取試劑盒（Qiagen 公司，德國）。實時定量PCR 引物及探針的設計主要參考文獻[8]，引物及探針由美國應用生物系統公司合成，具體引物及探針見表2。PCR反應條件：首先95 ℃10 min，然后95 ℃15 s 變性，60 ℃1 min 退火及延伸40 個循環。

表1 患者一般情況Table1 General data of the enrolled patients

表2 所用的引物或探針Table2 Used primers or probes

1.4 CD4+T 淋巴細胞計數檢測 取新鮮全血50 μl，放入專用的CD4+T 淋巴細胞絕對計數管中，加入CD3-FITC/CD4-PE/CD8-Percp 抗體，混勻后室溫避光孵育15 min，加入450 μl 免洗溶血素，充分混勻，室溫避光15 min 后上機，采用MultiSET 軟件自動計數系統檢測CD4+T 淋巴細胞絕對計數。

1.5 血漿HIV 載量的檢測 采用RNA 提取試劑盒提取血漿病毒RNA 后，利用羅氏HIV 定量檢測試劑盒（1.5 版本）檢測HIV 載量，檢測靈敏度為50 copies/ml 血漿。具體RNA 提取及定量檢測操作方法均嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.6 統計學處理 實驗數據采用SPSS 11.5 軟件進行分析處理。多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q 檢驗。各種形式的HIV DNA 與CD4+T 淋巴細胞計數及病毒載量之間的相關性采用Spearman 秩相關性分析。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同形式的HIV DNA 與疾病進展之間的相關性分析 總的HIV DNA 與病毒載量成中等程度正相關（r=0.485），與CD4+T 淋巴細胞計數呈弱負相關（r=-0.386）。整合的HIV DNA 與病毒載量無相關性，與CD4+T 淋巴細胞計數呈弱負相關（r=-0.346）。2 個LTR 的環狀HIV DNA 與病毒載量和CD4+T 淋巴細胞計數均無相關性。見表3。

表3 不同形式的HIV DNA 與病毒載量及CD4+ T 淋巴細胞計數的相關系數[r(P)]Table3 Correlation coefficient of the different forms of HIV DNA and viral loads and CD4+ T lymphocyte counts [r (P)]

2.2 病毒載量不同水平組HIV DNA 比較 根據病毒載量的水平將患者分為3 組：病毒載量＞105copies/ml 組（高病毒載量組）、104～105copies/ml 組及103～104copies/ml 組（低病毒載量組），每組各16例。高病毒載量組總的HIV DNA 明顯高于低病毒載量組（P=0.043），其整合的HIV DNA 亦高于104～105copies/ml 組（P=0.032）。2 個LTR 的環狀HIV DNA在3 組間差異無統計學意義。見圖1。

2.3 CD4+T 淋巴細胞不同水平組HIV DNA 比較 根據CD4+T 淋巴細胞水平將患者分為3 組：CD4+T淋巴細胞＞500 個/mm3組（高CD4 組）、350～500個/mm3組和＜350 個/mm3組（低CD4 組）。低CD4組整合的HIV DNA 明顯高于350～500 個/mm3組和高CD4 組（P 分別為0.027、0.000），其總的HIV DNA 亦高于350～500 個/mm3組和高CD4 組（P 分別為0.048、0.006）。2 個LTR 的環狀HIV DNA 在3組間差異無統計學意義。見圖2。

圖1 病毒載量不同水平組HIV DNA 比較Figure1 Comparison of HIV DNA among the groups with different viral loads

圖2 CD4+ T 淋巴細胞不同水平組HIV DNA 比較Figure2 Comparison of HIV DNA among the groups with different CD4+ T lymphocyte counts

2.4 不同感染時間組HIV DNA 比較 ≤60 d 組、60～90 d 組和90～365 d 組3 組間整合的HIV DNA差異無統計學意義。隨著感染時間的延長，總的HIV DNA 及2 個LTR 的環狀HIV DNA 均增加。90～365d 組總的HIV DNA 明顯高于60～90 d 組和≤60 d 組（P 分別為0.004、0.035），其2 個LTR 的環狀HIV DNA 亦高于60～90 d 組（P=0.003）。見圖3。

圖3 HIV 不同感染時間組HIV DNA 比較Figure3 Comparison of HIV DNA among the groups with different HIV infection time

3 討 論

目前，HIV RNA 是評價HIV 感染疾病進展及療效的重要指標[9]。對于HIV DNA 與疾病進展之間的關系目前研究存在爭議。一些研究認為整合的HIV DNA 是與疾病進展關系最密切的指標[10]；有一些研究則認為2 個LTR 的環狀HIV DNA 與疾病進展關系最密切，是反映病毒復制的重要指標[11]；還有一些文獻報道整合的HIV DNA 是反映病毒復制及疾病進展的重要指標[12-14]。研究存在差異的重要原因可能是患者的差異及采用的定量方法不同。在本研究中，我們采用Butler 等[8]報道的對HIV DNA 進行定量的方法對48例HIV/AIDS 患者進行HIV DNA 檢測。結果表明，總的HIV DNA 與疾病進展的關系最密切，相反，2 個LTR 的環狀HIV DNA 與疾病進展無相關性。一些文獻報道2 個LTR 的環狀HIV DNA 是最新HIV 復制的標志[11]，另有文獻報道其半衰期較短，在復制過程中它不穩定[15]。有研究認為整合的HIV DNA 是潛伏HIV 存在的重要形式[16]。我們的研究結果表明，整合的HIV DNA 相對較穩定，與疾病進展具有一定的相關性。因為總的HIV DNA 包括了各種形式的HIV DNA，所以單一的某種形式的HIV DNA 與疾病進展之間的關系都是片面的。

總之，我們的研究發現總的HIV DNA 與疾病進展的關系最密切，此研究將對于進一步揭示不同形式HIV DNA 的作用有重要意義。

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