HBV突變與HBV相關慢加急性肝衰竭相關性研究

張愛民，王慧芬，李桂英，李 玉，段學章

HBV 相關慢加急性肝衰竭（acute-on-chronic liver failure,ACLF）臨床病情危重、發展迅速、治療方法少，病死率高達50%～80%[1]。機體感染HBV 后可有不同的臨床結局，由病毒、肝細胞和宿主免疫系統相互作用決定。HBV 感染后的發病機制是免疫誘導的肝細胞損傷[2]，ACLF 則可能是這種免疫應答的異常反應[3]。因此，病毒及機體免疫反應就成為乙型肝炎發病機制的兩個主要因素。截止目前，病毒或免疫因素如何作用導致肝衰竭的發生仍然沒有明確的定論，HBV 突變是當下研究熱點[4-5]。本研究選取87例HBV 相關ACLF 患者為研究對象，以52例慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）、51例肝硬化（liver cirrhosis,LC）為對照，對HBV 前C（pre-core,PC）區、C 區、基本核心啟動子（basal core promoter,BCP）區的13 個基因位點進行測序，對比不同患者之間PC 區、C 區和BCP 區核苷酸突變率的差異，探討其與ACLF 之間的相關性。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2010年1月—2012年4月于我院住院診治的慢性HBV 感染者190例。所有患者均為血清HBV DNA 陽性，未曾進行干擾素和（或）核苷（酸）類似物抗病毒治療，經病史及實驗室檢查明確為感染6 個月以上。排除甲、丙、丁、戊型肝炎病毒重疊感染；排除合并CMV、EB 病毒和HIV 感染；排除合并自身免疫性肝炎、脂肪肝及酒精性肝病。肝衰竭診斷符合2006年《肝衰竭診療指南》[6]，慢性肝炎及肝硬化診斷符合2010年《慢性乙型肝炎防治指南》[7]。

1.2 實驗室檢測

1.2.1 生化及病毒學指標檢測 患者肝功能（ALT、AST、TBIL 和ALB）、凝血功能（PT、PA 和國際標準化比值）、HBV M 及HBV DNA 定量檢測等為住院期間由我院臨床檢驗醫學中心完成。

1.2.2 HBV 基因型、亞型和PC 區、C 區、BCP 區突變位點的檢測

1.2.2.1 引物設計與合成 根據HBV 基因組文庫數據，采用Primer 5.0 軟件，針對S 基因保守區共設計2 對巢式引物對HBV 進行分型。對B 和C 亞型采用半巢式，突變位點為巢式引物，引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成（表1）。

1.2.2.2 基因組DNA 提取和PCR 擴增

表1 HBV 基因分型和突變位點的引物序列Table1 HBV genotype classification and gene mutation primers

1.2.2.2.1 標本采集和保存 上述標本均取自患者外周靜脈血，干燥管靜置2 h，以3000 r/min 離心10 min，分離血清分裝于1.5 ml EP 管中，保存于-80 ℃冰箱，統一檢測。

1.2.2.2.2 基因組DNA 提取和PCR 擴增 參照Tiangen 試劑盒說明，取先證者及其12 名家系成員外周靜脈血。提取全血白細胞基因組DNA，-20 ℃保存。基因組DNA 模板行PCR 擴增。反應體系包括：基因組DNA 50 ng、上下游引物各0.5 μl（10 pmol）、dNTP（2.5 mmol）2 μl、rTaq 酶（TaKaRa 公司，日本）1 U、2×GC buffer Ⅰ緩沖液補充雙蒸水至20 μl。PCR 應用ABI 9700 熱循環儀，條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環35 次，72 ℃再延伸10 min。

1.2.2.3 PCR 產物純化、測序及序列分析 PCR 產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，純化后分別對擴增引物測序（北京華大基因研究中心），結果采用DNAStar 軟件子程序SeqMan 分析。

1.3 統計學處理 采用Stata 11.0 軟件對數據進行分析。正態分布的連續性數據如年齡、HBV DNA 用±s 表示，非正態分布的連續性數據如血清膽紅素、ALT、PA 水平用中位數（最小值，最大值）表示。3 組間率的比較采用R×C χ2檢驗，兩兩多重比較用Scheffe 法。發生ACLF 影響因素用logistic 回歸分析。P ＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 一般資料 190例慢性HBV 感染者中包括52例CHB（CHB 組）、51例LC（LC 組）和87例ACLF（ACLF 組）。患者年齡、性別、入組時肝功能和凝血功能等見表2。

2.2 190例BCP 區、前C 區和C 區基因突變分布 檢測190例的BCP 區、前C 區和C 區基因突變位點為1753（T→C/G）、1754（T→C）、1758（T→C）、1762（A →T）、1764（G →A）、1766（C →T）、1768（T→A）、1846（A →T）、1858（T→C）、1862（G →T）、1896（G→A）、1899（G→A）和1913（C→A/G）。CHB組的全陰數為12例（23.1%），遠遠大于LC 組和ACLF 組的0例（0%）和3例（3.5%）。CHB、LC、ACLF 3 組的13 個突變位點的總突變數分別為120、181、335 個，人均核苷酸突變檢出率分別為2.31、3.55、3.86 個。ACLF 組 中T1754G、T1758C、C1766T、T1768A、G1862T、T1858C 發生突變的病例數分別為7、5、7、4、1、4例，故未對這6 個位點的突變情況進一步分析統計。T1753C、A1762T、G1764A和G1899A 這4 個突變位點，LC 組核苷酸突變率高于CHB 組。A1762T、A1846T、G1899A 和C1913（A/G）4 個突變位點在ACLF 組和CHB 組之間差異均有統計學意義，CHB 組核苷酸突變率低于ACLF組。G1764A、A1846T 和C1913（A/G）在ACLF 組和LC 組之間差異有統計學意義，G1764A 位點突變率在LC 組高于ACLF 組，A1846T 和C1913（A/G）位點突變率在LC 組低于ACLF 組（表3）。

表2 CHB、LC 和ACLF 組臨床及病毒學特征Table2 Clinical and virological characteristics in patients with CHB,LC and ACLF

按患者在慢性肝炎或肝硬化基礎上發生ACLF，分為ACLF-CHB 組和ACLF-LC 組，分別為29例和58例，比較CHB 組和ACLF-CHB 組、LC組和ACLF-LC 組基因突變差異。結果提示A1846T和C1913（A/G）位點突變率在CHB 組低于ACLFCHB 組，在LC 組低于ACLF-LC 組（表4）。

表3 CHB、LC 和ACLF 組HBV 基因突變比較［例(%)］Table3 Comparison of HBV mutations among patients with CHB,LC and ACLF [cases (%)]

2.3 ACLF 發病影響因素的多因素分析 將HBeAg 是否陽性、HBV 基因分型是否為C 型及是否發生1753（T→C/G）、1762（A→T）、1764（G→A）、1846（A→T）、1899（G→A）和1913（C→A/G）位點突變設為自變量，是否發生ACLF 為因變量，進行logistic 回歸分析。自變量賦值如下：X1（HBeAg 陽性=1、陰性=0），X2（HBV 基因C 型=1、B 型=0），X3［1753（C/G）=1、1753T=0）］，X4（1762T=1、1762A=0），X5（1764A=1、1764G=0），X6（1846T=1、1846A=0），X7（1899A=1、1899G=0），X8（1913A/G=1、1913C=0），Y（發生ACLF=1、不發生ACLF=0）。結果表明1846（A→T）和1913（C→A/G）的OR 值分別為2.86 和5.93，均為發生ACLF 的危險因素（P＜0.05）。見表5。

表4 CHB 組與ACLF-CHB、LC 與ACLF-LC 組HBV 基因突變比較［例(%)］Table4 Comparison of HBV mutations between patients with CHB and ACLF-CHB,and between LC and ACLF- LC[cases (%)]

表5 ACLF 發病相關多因素分析Table5 Multivariable analysis of the occurrence of HBV-related ACLF

3 討 論

HBV 基因突變是CHB 疾病進展過程中在宿主的免疫壓力下病毒的正向選擇結果，突變株一般可減少病毒蛋白的產生，是病毒逃避免疫監視的一種方式[8]。由于這種機制，HBV 突變隨著疾病的進展逐步累積，以致不同疾病階段突變率明顯不同[9]。本研究顯示CHB 組野生型HBV 占23.1%，遠遠大于LC 和ACLF 組的0%和3.5%。CHB、LC和ACLF 3 組的人均HBV 核苷酸突變檢出率分別為2.31、3.55 和3.86 個。

關于HBV 的PC 區突變株感染與肝臟病變輕重的關系意見不一，大多數報道認為突變與肝臟病變程度相關，尤其與肝衰竭的發生密切相關[10-12]。本研究顯示PC 區G1899A 位點突變在LC 和ACLF組高于CHB 組，但3 組間差異無統計學意義。BCP區突變影響病情的報道較多，本研究中A1762T 和G1764A 位點突變率LC 組高于CHB 組，G1764A 位點突變率LC 組高于ACLF 組，但CHB 組和ACLF組G1764A 位點突變率比較差異無統計學意義，故考慮G1764A 位點突變與肝硬化相關，并不影響ACLF 的發生。A1846T 和C1913（A/G）位點突變率在CHB 組和LC 組均低于ACLF 組，但在CHB 組和LC 組間差異無統計學意義。按ACLF 發病基礎分為ACLF-CHB 和ACLF-LC 2 組，分別比較CHB組和ACLF-CHB 組、LC 組和ACLF-LC 組，結果同樣發現A1846T 和C1913（A/G）位點突變率在CHB組低于ACLF-CHB 組，LC 組低于ACLF-LC 組，故推測可能A1846T 和C1913（A/G）位點突變與ACLF有關。為進一步排除干擾因素，找出對ACLF 有意義的預測因素，我們對上述單因素分析有統計學意義的指標引入二項分類的logistic 回歸，應變量為是否發生ACLF。引入分析的指標有：HBeAg 狀態、HBV 基因分型、1753（T→C/G）、1762（A→T）、1764（G→A）、1846（A→T）、1899（G→A）和1913（C→A/G）。結果提示1846（A→T）和1913（C→A/G）位核苷酸突變是預測ACLF 的有效指標，OR 值分別為2.86 和5.93，提示1846（A→T）和1913（C→A/G）位點突變患者發生ACLF 的幾率分別是未發生突變患者的2.86 和5.93 倍。前期研究顯示A1846T 突變與肝臟炎癥及ACLF 發病有關[13-14]，相關發病機制尚不清楚。nt1913 位于C 區起始部位，既往對此位點突變的相關文獻較少。由于該位點突變可引起HBcAg 第5 位氨基酸的突變（脯氨酸→蘇氨酸/丙氨酸），該氨基酸位于HBcAg 人類白細胞分類抗原Ⅱ限制性輔助性T 細胞抗原表位，故nt1913 突變可能會引起該表位的變化，從而影響病情的嚴重程度[15-17]。

總之，ACLF 患者血清HBV 發生A1846T 和C1913（A/G）突變較CHB 和LC 患者更多，這一發現有助于了解不同肝病基礎上發生ACLF 的發病機制，并可能有助于預測慢性肝病是否發展為ACLF，但須進一步進行體外實驗來支持這一可能發病機制。

[1] Chisari FV,Isogawa M,Wieland SF．Pathogenesis of hepatitis B virus infection［J］.Pathol Biol(Paris),2010,58(4):258-266.

[2] Dumas L,Vergani D,Mieli-Vergani G.Hepatitis B virus:something old,something new［J］.J Pediatr Gastroenterol Nutr,2007,44(1):14-17.

[3] Sarin SK,Kumar A,Almeida JA,et al.Acute-on-chronic liver failure:consensus recommendations of the Asian Pacific Association for the Study of the Liver(APASL)［J］.Hepatol Int,2009,3(1):269-282.

[4] 侯金林.基因型和基因突變與乙型肝炎重癥化的關系［J］.中華肝臟病雜志,2010，18(2):85-87.

[5] 鄧國宏，王宇明.宿主遺傳背景與乙型肝炎重癥化［J］.中華肝臟病雜志,2010，18(2):88-91.

[6] 中華醫學會感染病學分會肝衰竭與人工肝學組，中華醫學會肝病分會重型肝病與人工肝學組.肝衰竭診療指南［J］.中華內科雜志，2006，45(12):1053-1056.

[7] 中華醫學會肝病學分會，中華醫學會感染病學分會.慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）［J］.傳染病信息，2011，24(1):Ⅲ-ⅩⅤ.

[8] Yuen MF，Sablon E，Yuan HJ，et a1．Significance of hepatitis B genotype in acute exacerbation,HBeAg seroconversion,cirrhosisrelated complications,and hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology,2003,3(3):562-567．

[9] Lok AS,McMahon BJ.Chronic hepatitis B［J］.Hepatology,2007,45(2):507-539．

[10] Carman WF,Jacyna MR,Hadziyannis S,et al.Mutation preventing formation of hepatitis B e antigen in patients with chronic hepatitis B infection［J］.Lancet,1989,2(8663):588-591.

[11] Yuen MF,Tanaka Y,Mizokami M,et al.Role of hepatitis B virus genotypes Ba and C,core promoter and precore mutationsonhepatocellular carcinoma:acasecontrol study［J］.Carcinogenesis,2004,25(9):1593-1598.

[12] Yu MC,Yuan JM,Govindarajan S,et al.Epidemiology of hepatocellular carcinoma［J］.JGastroenterol,2000,14(8):703-709．

[13] Xu Z,Ren X,Liu Y,et al. Association of hepatitis B virus mutations in basal corepromoter and precore regionswith severity of liver disease:aninvestigationof 793 Chinesepatientswith mild and severe chronic hepatitis B and acute-on-chronic liver failure［J］.JGastroenterol.2011,46(3):391-400.

[14] Yan T,Li K,Li F,et al.T1846 and A/G1913 are associated with acute on chronic liver failure in patients infected with hepatitis B virus genotypes B and C［J］.JMed Virol,2011,83(6):996-1004.

[15] Torre F,Cramp M,Owsianka A,et al.Direct evidence that naturally occurring mutations within hepatitis B core epitope alter CD4+T-cell reactivity［J］.JMed Virol,2004,72(3):370-376.

[16] 寧琴，武澤光，韓梅芳.難治性慢性乙型肝炎［J］.傳染病信息，2011，24(2):65-67.

[17] 丁劍波，羅曉嵐，田一梅，等.慢性乙型重型肝炎預后影響因素Logistic回歸分析［J］.傳染病信息，2012，25(3):161-163.