HBV突變與HBV相關(guān)慢加急性肝衰竭相關(guān)性研究

張愛民，王慧芬，李桂英，李 玉，段學(xué)章

HBV 相關(guān)慢加急性肝衰竭（acute-on-chronic liver failure,ACLF）臨床病情危重、發(fā)展迅速、治療方法少，病死率高達(dá)50%～80%[1]。機(jī)體感染HBV 后可有不同的臨床結(jié)局，由病毒、肝細(xì)胞和宿主免疫系統(tǒng)相互作用決定。HBV 感染后的發(fā)病機(jī)制是免疫誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷[2]，ACLF 則可能是這種免疫應(yīng)答的異常反應(yīng)[3]。因此，病毒及機(jī)體免疫反應(yīng)就成為乙型肝炎發(fā)病機(jī)制的兩個(gè)主要因素。截止目前，病毒或免疫因素如何作用導(dǎo)致肝衰竭的發(fā)生仍然沒有明確的定論，HBV 突變是當(dāng)下研究熱點(diǎn)[4-5]。本研究選取87例HBV 相關(guān)ACLF 患者為研究對(duì)象，以52例慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）、51例肝硬化（liver cirrhosis,LC）為對(duì)照，對(duì)HBV 前C（pre-core,PC）區(qū)、C 區(qū)、基本核心啟動(dòng)子（basal core promoter,BCP）區(qū)的13 個(gè)基因位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序，對(duì)比不同患者之間PC 區(qū)、C 區(qū)和BCP 區(qū)核苷酸突變率的差異，探討其與ACLF 之間的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 選取2010年1月—2012年4月于我院住院診治的慢性HBV 感染者190例。所有患者均為血清HBV DNA 陽性，未曾進(jìn)行干擾素和（或）核苷（酸）類似物抗病毒治療，經(jīng)病史及實(shí)驗(yàn)室檢查明確為感染6 個(gè)月以上。排除甲、丙、丁、戊型肝炎病毒重疊感染；排除合并CMV、EB 病毒和HIV 感染；排除合并自身免疫性肝炎、脂肪肝及酒精性肝病。肝衰竭診斷符合2006年《肝衰竭診療指南》[6]，慢性肝炎及肝硬化診斷符合2010年《慢性乙型肝炎防治指南》[7]。

1.2 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

1.2.1 生化及病毒學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 患者肝功能（ALT、AST、TBIL 和ALB）、凝血功能（PT、PA 和國際標(biāo)準(zhǔn)化比值）、HBV M 及HBV DNA 定量檢測(cè)等為住院期間由我院臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心完成。

1.2.2 HBV 基因型、亞型和PC 區(qū)、C 區(qū)、BCP 區(qū)突變位點(diǎn)的檢測(cè)

1.2.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)HBV 基因組文庫數(shù)據(jù)，采用Primer 5.0 軟件，針對(duì)S 基因保守區(qū)共設(shè)計(jì)2 對(duì)巢式引物對(duì)HBV 進(jìn)行分型。對(duì)B 和C 亞型采用半巢式，突變位點(diǎn)為巢式引物，引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成（表1）。

1.2.2.2 基因組DNA 提取和PCR 擴(kuò)增

表1 HBV 基因分型和突變位點(diǎn)的引物序列Table1 HBV genotype classification and gene mutation primers

1.2.2.2.1 標(biāo)本采集和保存 上述標(biāo)本均取自患者外周靜脈血，干燥管靜置2 h，以3000 r/min 離心10 min，分離血清分裝于1.5 ml EP 管中，保存于-80 ℃冰箱，統(tǒng)一檢測(cè)。

1.2.2.2.2 基因組DNA 提取和PCR 擴(kuò)增 參照Tiangen 試劑盒說明，取先證者及其12 名家系成員外周靜脈血。提取全血白細(xì)胞基因組DNA，-20 ℃保存。基因組DNA 模板行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系包括：基因組DNA 50 ng、上下游引物各0.5 μl（10 pmol）、dNTP（2.5 mmol）2 μl、rTaq 酶（TaKaRa 公司，日本）1 U、2×GC buffer Ⅰ緩沖液補(bǔ)充雙蒸水至20 μl。PCR 應(yīng)用ABI 9700 熱循環(huán)儀，條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35 次，72 ℃再延伸10 min。

1.2.2.3 PCR 產(chǎn)物純化、測(cè)序及序列分析 PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，純化后分別對(duì)擴(kuò)增引物測(cè)序（北京華大基因研究中心），結(jié)果采用DNAStar 軟件子程序SeqMan 分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Stata 11.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。正態(tài)分布的連續(xù)性數(shù)據(jù)如年齡、HBV DNA 用±s 表示，非正態(tài)分布的連續(xù)性數(shù)據(jù)如血清膽紅素、ALT、PA 水平用中位數(shù)（最小值，最大值）表示。3 組間率的比較采用R×C χ2檢驗(yàn)，兩兩多重比較用Scheffe 法。發(fā)生ACLF 影響因素用logistic 回歸分析。P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料 190例慢性HBV 感染者中包括52例CHB（CHB 組）、51例LC（LC 組）和87例ACLF（ACLF 組）。患者年齡、性別、入組時(shí)肝功能和凝血功能等見表2。

2.2 190例BCP 區(qū)、前C 區(qū)和C 區(qū)基因突變分布 檢測(cè)190例的BCP 區(qū)、前C 區(qū)和C 區(qū)基因突變位點(diǎn)為1753（T→C/G）、1754（T→C）、1758（T→C）、1762（A →T）、1764（G →A）、1766（C →T）、1768（T→A）、1846（A →T）、1858（T→C）、1862（G →T）、1896（G→A）、1899（G→A）和1913（C→A/G）。CHB組的全陰數(shù)為12例（23.1%），遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于LC 組和ACLF 組的0例（0%）和3例（3.5%）。CHB、LC、ACLF 3 組的13 個(gè)突變位點(diǎn)的總突變數(shù)分別為120、181、335 個(gè)，人均核苷酸突變檢出率分別為2.31、3.55、3.86 個(gè)。ACLF 組 中T1754G、T1758C、C1766T、T1768A、G1862T、T1858C 發(fā)生突變的病例數(shù)分別為7、5、7、4、1、4例，故未對(duì)這6 個(gè)位點(diǎn)的突變情況進(jìn)一步分析統(tǒng)計(jì)。T1753C、A1762T、G1764A和G1899A 這4 個(gè)突變位點(diǎn)，LC 組核苷酸突變率高于CHB 組。A1762T、A1846T、G1899A 和C1913（A/G）4 個(gè)突變位點(diǎn)在ACLF 組和CHB 組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CHB 組核苷酸突變率低于ACLF組。G1764A、A1846T 和C1913（A/G）在ACLF 組和LC 組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，G1764A 位點(diǎn)突變率在LC 組高于ACLF 組，A1846T 和C1913（A/G）位點(diǎn)突變率在LC 組低于ACLF 組（表3）。

表2 CHB、LC 和ACLF 組臨床及病毒學(xué)特征Table2 Clinical and virological characteristics in patients with CHB,LC and ACLF

按患者在慢性肝炎或肝硬化基礎(chǔ)上發(fā)生ACLF，分為ACLF-CHB 組和ACLF-LC 組，分別為29例和58例，比較CHB 組和ACLF-CHB 組、LC組和ACLF-LC 組基因突變差異。結(jié)果提示A1846T和C1913（A/G）位點(diǎn)突變率在CHB 組低于ACLFCHB 組，在LC 組低于ACLF-LC 組（表4）。

表3 CHB、LC 和ACLF 組HBV 基因突變比較［例(%)］Table3 Comparison of HBV mutations among patients with CHB,LC and ACLF [cases (%)]

2.3 ACLF 發(fā)病影響因素的多因素分析 將HBeAg 是否陽性、HBV 基因分型是否為C 型及是否發(fā)生1753（T→C/G）、1762（A→T）、1764（G→A）、1846（A→T）、1899（G→A）和1913（C→A/G）位點(diǎn)突變?cè)O(shè)為自變量，是否發(fā)生ACLF 為因變量，進(jìn)行l(wèi)ogistic 回歸分析。自變量賦值如下：X1（HBeAg 陽性=1、陰性=0），X2（HBV 基因C 型=1、B 型=0），X3［1753（C/G）=1、1753T=0）］，X4（1762T=1、1762A=0），X5（1764A=1、1764G=0），X6（1846T=1、1846A=0），X7（1899A=1、1899G=0），X8（1913A/G=1、1913C=0），Y（發(fā)生ACLF=1、不發(fā)生ACLF=0）。結(jié)果表明1846（A→T）和1913（C→A/G）的OR 值分別為2.86 和5.93，均為發(fā)生ACLF 的危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。見表5。

表4 CHB 組與ACLF-CHB、LC 與ACLF-LC 組HBV 基因突變比較［例(%)］Table4 Comparison of HBV mutations between patients with CHB and ACLF-CHB,and between LC and ACLF- LC[cases (%)]

表5 ACLF 發(fā)病相關(guān)多因素分析Table5 Multivariable analysis of the occurrence of HBV-related ACLF

3 討 論

HBV 基因突變是CHB 疾病進(jìn)展過程中在宿主的免疫壓力下病毒的正向選擇結(jié)果，突變株一般可減少病毒蛋白的產(chǎn)生，是病毒逃避免疫監(jiān)視的一種方式[8]。由于這種機(jī)制，HBV 突變隨著疾病的進(jìn)展逐步累積，以致不同疾病階段突變率明顯不同[9]。本研究顯示CHB 組野生型HBV 占23.1%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于LC 和ACLF 組的0%和3.5%。CHB、LC和ACLF 3 組的人均HBV 核苷酸突變檢出率分別為2.31、3.55 和3.86 個(gè)。

關(guān)于HBV 的PC 區(qū)突變株感染與肝臟病變輕重的關(guān)系意見不一，大多數(shù)報(bào)道認(rèn)為突變與肝臟病變程度相關(guān)，尤其與肝衰竭的發(fā)生密切相關(guān)[10-12]。本研究顯示PC 區(qū)G1899A 位點(diǎn)突變?cè)贚C 和ACLF組高于CHB 組，但3 組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。BCP區(qū)突變影響病情的報(bào)道較多，本研究中A1762T 和G1764A 位點(diǎn)突變率LC 組高于CHB 組，G1764A 位點(diǎn)突變率LC 組高于ACLF 組，但CHB 組和ACLF組G1764A 位點(diǎn)突變率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故考慮G1764A 位點(diǎn)突變與肝硬化相關(guān)，并不影響ACLF 的發(fā)生。A1846T 和C1913（A/G）位點(diǎn)突變率在CHB 組和LC 組均低于ACLF 組，但在CHB 組和LC 組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。按ACLF 發(fā)病基礎(chǔ)分為ACLF-CHB 和ACLF-LC 2 組，分別比較CHB組和ACLF-CHB 組、LC 組和ACLF-LC 組，結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)A1846T 和C1913（A/G）位點(diǎn)突變率在CHB組低于ACLF-CHB 組，LC 組低于ACLF-LC 組，故推測(cè)可能A1846T 和C1913（A/G）位點(diǎn)突變與ACLF有關(guān)。為進(jìn)一步排除干擾因素，找出對(duì)ACLF 有意義的預(yù)測(cè)因素，我們對(duì)上述單因素分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)引入二項(xiàng)分類的logistic 回歸，應(yīng)變量為是否發(fā)生ACLF。引入分析的指標(biāo)有：HBeAg 狀態(tài)、HBV 基因分型、1753（T→C/G）、1762（A→T）、1764（G→A）、1846（A→T）、1899（G→A）和1913（C→A/G）。結(jié)果提示1846（A→T）和1913（C→A/G）位核苷酸突變是預(yù)測(cè)ACLF 的有效指標(biāo)，OR 值分別為2.86 和5.93，提示1846（A→T）和1913（C→A/G）位點(diǎn)突變患者發(fā)生ACLF 的幾率分別是未發(fā)生突變患者的2.86 和5.93 倍。前期研究顯示A1846T 突變與肝臟炎癥及ACLF 發(fā)病有關(guān)[13-14]，相關(guān)發(fā)病機(jī)制尚不清楚。nt1913 位于C 區(qū)起始部位，既往對(duì)此位點(diǎn)突變的相關(guān)文獻(xiàn)較少。由于該位點(diǎn)突變可引起HBcAg 第5 位氨基酸的突變（脯氨酸→蘇氨酸/丙氨酸），該氨基酸位于HBcAg 人類白細(xì)胞分類抗原Ⅱ限制性輔助性T 細(xì)胞抗原表位，故nt1913 突變可能會(huì)引起該表位的變化，從而影響病情的嚴(yán)重程度[15-17]。

總之，ACLF 患者血清HBV 發(fā)生A1846T 和C1913（A/G）突變較CHB 和LC 患者更多，這一發(fā)現(xiàn)有助于了解不同肝病基礎(chǔ)上發(fā)生ACLF 的發(fā)病機(jī)制，并可能有助于預(yù)測(cè)慢性肝病是否發(fā)展為ACLF，但須進(jìn)一步進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)來支持這一可能發(fā)病機(jī)制。

[1] Chisari FV,Isogawa M,Wieland SF．Pathogenesis of hepatitis B virus infection［J］.Pathol Biol(Paris),2010,58(4):258-266.

[2] Dumas L,Vergani D,Mieli-Vergani G.Hepatitis B virus:something old,something new［J］.J Pediatr Gastroenterol Nutr,2007,44(1):14-17.

[3] Sarin SK,Kumar A,Almeida JA,et al.Acute-on-chronic liver failure:consensus recommendations of the Asian Pacific Association for the Study of the Liver(APASL)［J］.Hepatol Int,2009,3(1):269-282.

[4] 侯金林.基因型和基因突變與乙型肝炎重癥化的關(guān)系［J］.中華肝臟病雜志,2010，18(2):85-87.

[5] 鄧國宏，王宇明.宿主遺傳背景與乙型肝炎重癥化［J］.中華肝臟病雜志,2010，18(2):88-91.

[6] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)肝衰竭與人工肝學(xué)組，中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病分會(huì)重型肝病與人工肝學(xué)組.肝衰竭診療指南［J］.中華內(nèi)科雜志，2006，45(12):1053-1056.

[7] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì).慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）［J］.傳染病信息，2011，24(1):Ⅲ-ⅩⅤ.

[8] Yuen MF，Sablon E，Yuan HJ，et a1．Significance of hepatitis B genotype in acute exacerbation,HBeAg seroconversion,cirrhosisrelated complications,and hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology,2003,3(3):562-567．

[9] Lok AS,McMahon BJ.Chronic hepatitis B［J］.Hepatology,2007,45(2):507-539．

[10] Carman WF,Jacyna MR,Hadziyannis S,et al.Mutation preventing formation of hepatitis B e antigen in patients with chronic hepatitis B infection［J］.Lancet,1989,2(8663):588-591.

[11] Yuen MF,Tanaka Y,Mizokami M,et al.Role of hepatitis B virus genotypes Ba and C,core promoter and precore mutationsonhepatocellular carcinoma:acasecontrol study［J］.Carcinogenesis,2004,25(9):1593-1598.

[12] Yu MC,Yuan JM,Govindarajan S,et al.Epidemiology of hepatocellular carcinoma［J］.JGastroenterol,2000,14(8):703-709．

[13] Xu Z,Ren X,Liu Y,et al. Association of hepatitis B virus mutations in basal corepromoter and precore regionswith severity of liver disease:aninvestigationof 793 Chinesepatientswith mild and severe chronic hepatitis B and acute-on-chronic liver failure［J］.JGastroenterol.2011,46(3):391-400.

[14] Yan T,Li K,Li F,et al.T1846 and A/G1913 are associated with acute on chronic liver failure in patients infected with hepatitis B virus genotypes B and C［J］.JMed Virol,2011,83(6):996-1004.

[15] Torre F,Cramp M,Owsianka A,et al.Direct evidence that naturally occurring mutations within hepatitis B core epitope alter CD4+T-cell reactivity［J］.JMed Virol,2004,72(3):370-376.

[16] 寧琴，武澤光，韓梅芳.難治性慢性乙型肝炎［J］.傳染病信息，2011，24(2):65-67.

[17] 丁劍波，羅曉嵐，田一梅，等.慢性乙型重型肝炎預(yù)后影響因素Logistic回歸分析［J］.傳染病信息，2012，25(3):161-163.