代謝組學中核磁共振技術的數(shù)據(jù)分析方法

孫雨航，許楚楚，徐 闖，李昌盛，吳 凌，夏 成

（黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江 大慶163319）

近年來，隨著科學技術的不斷創(chuàng)新，各種組學（Omics）技術應運而生。1999年Nicholson首次給出了代謝組學（Metabolomics）的完整定義，是研究在內、外因素作用下，生物體所含內源性小分子代謝物（相對分子質量小于1 000）在種類和數(shù)量上的動態(tài)變化規(guī)律以及生理、病理變化的一門技術[1]。代謝組學主要包括3個檢測平臺，分別為氣相色譜質譜聯(lián)用，液相色譜質譜聯(lián)用和核磁共振技術（nuclearmagnetic resonance，NMR）。其中，NMR已被廣泛應用于生命科學的各個領域。

1 NMR數(shù)據(jù)預處理

從生物學角度來說，生物種類繁多，內源性代謝物濃度差異很大，濃度高的代謝物不一定比濃度低的代謝物更重要，而某些濃度非常低的代謝物在某些生理過程中恰恰不容忽視[2]，所以為了保證所有的化合物在無偏性NMR檢測后能夠得到公平的分析，就需要對圖譜數(shù)據(jù)進行標準化，主要包括歸一化、中心化和尺度方差規(guī)模化。

目前常規(guī)使用的數(shù)據(jù)預處理軟件是Topspin（Bruker GmBH，Karlsruhe，Germany）和MestReNova（Mestrelab Research，Santiago de Compostela，Spain）。在Topspin軟件中，所有原始譜圖自動進行分段積分，手動調零、校正基線和相位；在MestReNova軟件中，原始譜圖被保存為包含所有代謝物化學位移的“txt”文本，用于后續(xù)統(tǒng)計分析。

2 多變量模式識別軟件

為了從大量的NMR數(shù)據(jù)中得到有價值的代謝物，需要運用降維思想，借助多變量模式識別[3]。目前，常用的模式識別軟件通常是昂貴的商用軟件或者內部教學軟件，主要包括SMICA（Umetrics，Ume?，Sweden）和R語言（www.R-project.org），前者最為常見，操作簡便且智能化，但是分析模式較少；后者指令復雜，需要專業(yè)人員操做，但是模式識別種類較多。最近，研究學者又提出了一種新的核磁數(shù)據(jù)處理軟件MVAPACK，它可以完成數(shù)據(jù)預處理、模式識別和模型驗證的整個過程，并已通過實踐檢驗，相信不久的將來許多研究學者可以通過應用免費軟件親自進行數(shù)據(jù)分析。

3 主成分分析（Principal component analysis，PCA）

PCA類似于聚類分析，是一種無師監(jiān)督分析方法。從數(shù)學角度來說，PCA是一種高緯數(shù)據(jù)降緯的方法，就是將分散在一組變量的信息集中到某幾個綜合指標（主要成分）上[3]，從而利用主要成分提取數(shù)據(jù)集的特征，形成一個二維或三維的得分圖[4]。從生物學角度來說，PCA就是在不分組的情況下，從整體上來描述樣品的離散趨勢[5]。

在PCA得分圖中，通常以前兩個主成分（PC1、PC2）為參數(shù)構建模型，主成分后的數(shù)值代表此成分對于模型分組的貢獻率，數(shù)值越大表示其對分組的主導作用越大。通常，所有的樣品都將呈現(xiàn)在一個95%的置信區(qū)間中，區(qū)間以外的樣品被視為異常值。需要注意的是，對于異常值的處理，需要進行異常值檢測[6]，建立離群模型[7]，綜合考慮分析結果及其生物學意義，再決定是否剔除。因此，當樣品組間差異較大，組內差異較小時，PCA可以很好地區(qū)分不同組樣品。但是，當組間差異較小，組內差異較大（組內差異變量甚至大于樣本含量）時，樣本含量較大的一組將會主導模型，無法呈現(xiàn)組間差異，需要進行有師監(jiān)督的模式識別來凸顯組間差異。

4 偏最小二乘法判別分析（Partial least squares discrim inant ana lysis，PLS-DA）

PLS-DA是一種有師監(jiān)督分析方法（可以通過多次練習達到最佳效果），通過利用已知樣品分組信息對多變量數(shù)據(jù)進行歸類、識別和預測[8]。從模型構建上來說，PLS-DA是對PCA模型的延伸，在PCA模型不分組的基礎上利用虛擬變量分組，人為地將組別定義為Y變量，從而凸顯組間差異。

此外，PLS-DA模型還是一種線性分析法，其優(yōu)勢就在于其可以結合載荷圖篩選出代謝物差異[9]，鑒別生物標記物[10]。PLS-DA模型也存在自身局限性，因為多變量和偏差系數(shù)的存在可能使其忽視真正的相關變量[11]。

5 正交的偏最小二乘法判別分析（Orthogonalpartial least squares discrim inant ana lysis，OPLS-DA）

OPLS-DA的構建就是為了對PLS-DA進行修正，通過移除與Y變量（分組）無關的X變量從而最大化組間差異，也可以將其看做一個純粹的數(shù)據(jù)預處理過程，或者是一個具有正交變量優(yōu)勢的簡單PLS-DA模型[11]。

與PLS-DA模型相同，在OPLS-DA模型中，參數(shù)R2表示模型的解釋率，Q2表示模型的預測率，R2和Q2的比值越接近于1表示模型越可靠。

OPLS-DA模型驗證包括：內部驗證，7倍交差驗證和1 000次（200次）排列驗證；外部驗證：應用受試者工作特征（ReceiverOperating Characteristic，ROC）曲線確定生物標記物的準確性、敏感性和特異性[12]。

對于篩選生物標記物，則需要結合載荷圖、S圖、皮爾遜相關系數(shù)，單因素方差分析和學生t檢驗的P值等，來確定差異代謝物，然后進行代謝物通路分析，最終完成生物標記物的鑒定。條件允許的情況下，還可以進行生物標記物的相關性分析，甚至計算臨界值[13]。

6 OSC-PLS-DA

OSC被認為是一種基于PLS模型的數(shù)據(jù)過濾處理技術，能夠移除與Y響應矩陣不相關的X矩陣，從而使基于相關性X矩陣的PLS模型能夠更加專一地分析有意義變量。有報道指出，OSC-PLS-DA就是在PLS-DA[14]或OPLS-DA[15]基礎上結合正交信號修正過濾器所建立的分析模型，并且OSC還可以對PCA模型[16]或NMR光譜[17]進行優(yōu)化。在OSC-PLS-DA模型中，OSC可以等于0，1，2，3···，直到PLS-DA模型最佳為止，通過一次次去掉與模型分組無關的潛在變量，達到最大化組間差異的目的。

7 結論

核磁數(shù)據(jù)預處理是保證所有數(shù)據(jù)能夠被公平地進行多變量模式識別的基礎；PCA是首要的，是對所有變量的無偏性呈現(xiàn)，能夠使人們從整體上把握樣品水平；而其他3種方法是平行的，互相之間有比較也有優(yōu)化，都能夠直接應用于篩選生物標記物。在應用時需要根據(jù)樣品組成選擇合適的模式識別，使之既不過于復雜又能獲得理想效果。

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