復(fù)制因子C蛋白復(fù)合物功能研究進(jìn)展

李依馳，崔 看，陳 錦，成 平，陳良城，夏石頭*

(1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/湖南省植物激素與生長(zhǎng)發(fā)育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙410128;2湖南省西瓜甜瓜研究所，長(zhǎng)沙410125;3湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)信息與工程研究所，長(zhǎng)沙410125)

復(fù)制因子C(replication factor C，RFC)最早是從人類的宮頸癌Hela細(xì)胞提取物中純化得到的，由5個(gè)大小結(jié)構(gòu)不同的亞基組成的蛋白復(fù)合物，并發(fā)現(xiàn)它是猿病毒40(simianvirus 40，SV40)DNA在體外復(fù)制的必需因子［1，2］。人們以酵母、老鼠、果蠅和人類細(xì)胞等為研究材料，相繼確定了酵母、老鼠、果蠅和人類細(xì)胞中RFC復(fù)合蛋白各亞基及其編碼基因，并發(fā)現(xiàn)很多真核生物中都存在著該蛋白復(fù)合物［3～6］。隨著研究的不斷深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到RFC復(fù)合蛋白復(fù)合物作為一個(gè)整體，其在DNA復(fù)制與修復(fù)及細(xì)胞分裂增殖和抗逆生長(zhǎng)中具有重要的功能。而在植物中，F(xiàn)urukawa等［7］在水稻中利用同系物克隆法成功分離了水稻復(fù)制因子C(Oryza sativa L.RFC，OSRFC)的5個(gè)亞基，分析了其表達(dá)部位及其分子特性，自此人們開(kāi)始對(duì)于RFC復(fù)合體在植物中的重要作用進(jìn)行研究。但是由于RFC是DNA復(fù)制必需因子，其編碼基因突變極可能導(dǎo)致植株死亡，因此有關(guān)植物中RFC的報(bào)道較少。

1 RFC蛋白復(fù)合體的組成與功能

RFC復(fù)合物是位于真核生物復(fù)制叉上的結(jié)構(gòu)特異性DNA結(jié)合蛋白，主要作用是在DNA復(fù)制過(guò)程中，將增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)裝載到DNA鏈上，并在有脫氧核糖核酸存在的條件下通過(guò)人類單鏈DNA結(jié)合蛋白(human single－stranded DNA binding protein，hSSB)的作用而準(zhǔn)確高效的延伸 DNA復(fù)制鏈［8，9］。RFC蛋白復(fù)合物由5個(gè)亞基組成，其1個(gè)大亞基(RFC1/140 kD)和4個(gè)小亞基(RFC2/37 kD，RFC3/36 kD，RFC4/40 kD，RFC5/38 kD)，普遍存在于真核生物中。而隨后在對(duì)RFC以及5個(gè)亞基的功能研究后發(fā)現(xiàn)，RFC以及5個(gè)亞基在真核生物中都具有重要的生物學(xué)功能［3～6］。

在真核生物復(fù)制時(shí)，RFC具有激活多聚酶組裝的作用［10，11］，同時(shí)在 SV40 的 DNA 復(fù)制起始點(diǎn)、DNA領(lǐng)頭鏈起始合成中多聚酶由polα轉(zhuǎn)換為polδ時(shí)和隨后鏈延伸過(guò)程中岡崎片段合成時(shí)的作用也是必不可少的。同時(shí)RFC復(fù)合物整體參與了DNA復(fù)制S期細(xì)胞周期檢查點(diǎn)控制，而RFC的4個(gè)小亞基能與Rad24形成一個(gè)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，參與在S期以外的細(xì)胞周期檢查點(diǎn)控制的途徑［12］。而在細(xì)胞分裂時(shí)，RFC與Ctf18p、Ctf8p或Dcc1p形成的復(fù)合物使姐妹染色單體能夠準(zhǔn)確的合成，此外，RFC及其亞基在細(xì)胞分裂增殖及抗逆性生長(zhǎng)等方面也起作用［13～16］。

2 酵母和人類RFC各亞基的功能

酵母RFC的5個(gè)亞基都是酵母細(xì)胞增殖所必需的，除序列高度相似外，都含有ATP/GTP結(jié)合蛋白特性的保守區(qū)域。酵母復(fù)制因子C(Saccharomyces cerevisiae RFC，ScRFC1)與細(xì)胞分裂周期蛋白44(Cell division cycle protein 44，CDC44)相似。CDC44是一個(gè)細(xì)胞分裂周期基因，其編碼蛋白參與DNA代謝。CDC44/RFC1與ScPCNA蛋白編碼基因在遺傳學(xué)水平上相互作用，同時(shí)證實(shí)了它們?cè)贒NA復(fù)制時(shí)存在著相互作用［17］。與人類 RFC(human RFC，hRFC)活性相似，ScRFC是細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的并表現(xiàn)出單鏈DNA依賴型ATP酶活性［18］。

通過(guò)不斷的研究積累，可以推測(cè)RFC的各個(gè)不同亞基的功能可能也有所不同。2005年，Kim等［19］發(fā)現(xiàn)，在裂變酵母中RFC1的C末端結(jié)構(gòu)域是維持其體內(nèi)功能所必需的，該結(jié)構(gòu)域的突變會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)染色體復(fù)制異常。而RFC1的超表達(dá)能夠消除因組蛋白H3K56的超乙酰化而引起的細(xì)胞死亡［20］。Tang等［21］研究發(fā)現(xiàn)，hRFC1在早年衰老綜合癥(Hutchinson Gilford Progeria Syndrome，HGPS)細(xì)胞中存在裂解的現(xiàn)象，導(dǎo)致產(chǎn)生被截短了的RFC1(分子量為75 kD)，這種有缺陷的RFC1影響了DNA復(fù)制過(guò)程中PCNA和polδ的加載。有趣的是，這個(gè)裂解過(guò)程可以被一個(gè)絲氨酸蛋白酶抑制劑所抑制，這就表明RFC1是被絲氨酸蛋白酶所裂解的。因而這種獨(dú)特的被截短了的RFC1可以作為一個(gè)潛在HGPS的標(biāo)志。而RFC2、RFC3與c－MYC致癌基因(轉(zhuǎn)錄因子)的相互作用，能引發(fā)細(xì)胞的分裂增生［22］。崔金全等［23］通過(guò)基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，葡萄胎和絨毛膜癌存在RFC高表達(dá)，而RFC2與DNA的復(fù)制和修復(fù)及細(xì)胞周期信號(hào)檢查點(diǎn)的功能有關(guān)，還與PCNA一起參與細(xì)胞DNA損傷后的錯(cuò)配修復(fù)和切除修復(fù)機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，人類RFC5是結(jié)合到PCNA的C末端的，人類RFC5在人類乳頭狀瘤病毒(Human papillomaviruses，HPV)病毒呈陽(yáng)性的頭頸鱗片狀的細(xì)胞瘤(squamous cell carcinoma of the heda and neck，SCCHN)中的表達(dá)量上調(diào)［24］，且RFC5是打開(kāi)DNA復(fù)制夾PCNA所必需的，RFC1則不是打開(kāi)PCNA所必需的。RFC5可與Ctfl8結(jié)合形成Ctfl8－RFC5，并在DNA復(fù)制和姊妹染色體配對(duì)中起重要作用［25，26］。Gellon等最近的研究結(jié)果則表明，除在姊妹染色體配對(duì)中起作用外，Ctfl8－RFC在基因組穩(wěn)定性方面也有重要作用［27］。

3 植物RFC各亞基的功能

雖然人類和動(dòng)物中關(guān)于RFC的功能研究進(jìn)展很快，但植物中有關(guān)RFC及其各亞基的研究卻因起步較晚、研究的關(guān)注點(diǎn)不同等多方面的原因，鮮有報(bào)道。直到2003年，F(xiàn)urukawa等［7］通過(guò)同系物克隆在水稻中成功分離了OsRFC的5個(gè)亞基，且5個(gè)亞基分別位于水稻的不同染色體上:OsRFC1(位于11號(hào)染色體上，110.8 kD)、OsRFC2(位于12號(hào)染色體上，37.4 kD)、OsRFC3(位于 2號(hào)染色體上，40.3 kD)、OsRFC4(位于 4號(hào)染色體上，36.8 kD)和OsRFC5(位于3號(hào)染色體上，40.5 kD)。OsRFC的5個(gè)亞基都含RFC蛋白高度保守的氨基酸花邊序列——RFC盒(RFC box)。這些亞基在不同組織中表達(dá)類型不同，在分生組織、莖尖分生組織中表達(dá)很強(qiáng)，而在不含分生組織的成熟葉中表達(dá)量很低。但由于在水稻中未能獲得相應(yīng)的RFC突變體植株，因此難以在水稻中繼續(xù)對(duì)RFC的功能進(jìn)行研究。其主要原因可能是RFC復(fù)合蛋白體是DNA復(fù)制的必需因子，其編碼基因突變會(huì)導(dǎo)致植株死亡。

為了進(jìn)一步研究RFC在植物中的功能，夏石頭等［28］以擬南芥為載體，研究了 AtRFC1的3個(gè)TDNA插入突變株系rfc1－1、rfc1－2和rfc1－3，并發(fā)現(xiàn)T－DNA在AtRFC1外顯子中插入突變將引起種子胚胎發(fā)育異常從而導(dǎo)致種子敗育。將野生型AtRFC1通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入到擬南芥突變體中時(shí)，卻恢復(fù)了突變株的野生型表型，進(jìn)一步說(shuō)明AtRFC1在種子胚胎發(fā)育中起重要作用，AtRFC1突變是導(dǎo)致胚胎發(fā)生異常和種子敗育的原因。有研究發(fā)現(xiàn)，rfc1可解除ros1－1(repressor of silencing1－1)對(duì)基因沉默的轉(zhuǎn)錄抑制，重新激活ros1－1突變體中35SNPTII(外源導(dǎo)入基因)的表達(dá)，表明AtRFC1可能在擬南芥基因組穩(wěn)定性和基因轉(zhuǎn)錄沉默(transcriptional gene silencing，TGS)中起重要作用［29］。同時(shí)，At-RFC1缺陷將導(dǎo)致擬南芥對(duì)DNA損傷敏感性提高和高概率的同源重組，在減數(shù)分裂期，RFC1對(duì)于DNA后隨鏈的形成有重要作用，rfc1突變將導(dǎo)致不正常的染色體聯(lián)結(jié)，花粉的敗育和其他細(xì)胞學(xué)的缺陷等［30］。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，AtRFC1在ABA調(diào)節(jié)的同源重組中起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用［31］。夏石頭等通過(guò)EMS誘變，得到了一個(gè)葉型和株型與SA誘導(dǎo)型抗病突變體sni1(suppressor of npr1－1，inducible 1)相似，即株型較小、早花、葉片狹長(zhǎng)且葉面積較小的突變體。sni1是在對(duì)病程相關(guān)蛋白不表達(dá)的突變體npr1(nonexpressor of PR genes)進(jìn)行抑制突變時(shí)篩選出來(lái)的，SNI1在水楊酸誘導(dǎo)型抗病反應(yīng)中起重要作用。通過(guò)雜交試驗(yàn)表明，該突變體不是sni1，而是一個(gè)新的突變體。通過(guò)對(duì)該突變體進(jìn)行基因圖位克隆，夏石頭等確定該突變是AtRFC3基因的點(diǎn)突變r(jià)fc3－1，該點(diǎn)突變導(dǎo)致RFC3中第三個(gè)非常保守的結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)非極性脂肪族氨基酸(Gly－85)被替代成為一個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸(ASP)，從而影響了RFC3與其他亞基的結(jié)合［32］。與野生型相比，rfc3－1植株對(duì)病原菌Peronospora parasitica(P.p.)Noco2的抗性顯著增強(qiáng)，檢測(cè)突變體內(nèi)抗病基因PR1和PR2的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，rfc3－1植株P(guān)R1和PR2基因表達(dá)量大幅上調(diào);更進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該上調(diào)是不依賴于 NPR1蛋白的，說(shuō)明RFC3在SA誘導(dǎo)的植物系統(tǒng)獲得性抗性中起負(fù)調(diào)控作用［33］。

同時(shí)，RFC3基因突變嚴(yán)重影響植株的生長(zhǎng)發(fā)育，并削弱了植株抗紫外輻射的能力，說(shuō)明RFC3在植物生長(zhǎng)發(fā)育中也有重要的生物學(xué)功能［34］。陳良城等［35］發(fā)現(xiàn)，rfc3－1植株對(duì) MMS與 cisplatin的抗性減弱，而rfc3－1/RFC3植株與野生型沒(méi)有差異，說(shuō)明RFC3對(duì)植物核酸損傷修復(fù)有重要作用。陳良城［36］對(duì)擬南芥RFC5進(jìn)行RNAi干擾，獲得 rfc5突變體，對(duì)其研究發(fā)現(xiàn)，rfc5突變體具有相對(duì)于野生型要矮小，側(cè)根少，葉片細(xì)小，花器官生長(zhǎng)受限等生長(zhǎng)發(fā)育特征。通過(guò)對(duì)rfc5突變體進(jìn)行DNA毒性物質(zhì)MMS和cisplatin處理實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)rfc5突變體抗性減弱，而 rfc5/RFC5植株與野生型沒(méi)有差異，說(shuō)明RFC5對(duì)植物核酸損傷修復(fù)有重要作用。

4 展望

雖然近年來(lái)，在對(duì)水稻和模式植物擬南芥的RFC及各亞基的功能研究方面已經(jīng)獲得一些進(jìn)展，但仍存在許多問(wèn)題，如rfc3－1突變體純合子植株與另一個(gè)突變體sni1在形態(tài)和抗病表型上很相似，這兩種蛋白是否存在相互作用或者聯(lián)系?植物中復(fù)制因子C復(fù)合物其他小亞基如RFC2和RFC4的功能如何?RFC與其他突變表型類似的基因之間是否存在著相互作用?整個(gè)作用通路與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)又是怎樣工作的?這些問(wèn)題都值得更深入的研究和探討。

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