FMNL3基因轉染對結直腸癌SW480細胞EMT和體外侵襲能力的影響*

曾元鳳,肖移生,羅小江,胡國柱,路名芝,吳曉牧,辛洪波

(1.江西省人民醫院病理科,江西南昌 330006;2.江西中醫藥大學基礎醫學院形態學教研室,江西南昌,330004;3.江西省人民醫院普外科,江西南昌 330006;4.江西省人民醫院干細胞重點實驗室,江西南昌 330006;5.江西省人民醫院神經內科,江西南昌 330006;6.南昌大學轉化醫學研究院,江西南昌, 330031)

FMNL3基因轉染對結直腸癌SW480細胞EMT和體外侵襲能力的影響*

曾元鳳1,肖移生2,羅小江3,胡國柱4,路名芝1,吳曉牧5△,辛洪波6▲

(1.江西省人民醫院病理科,江西南昌 330006;2.江西中醫藥大學基礎醫學院形態學教研室,江西南昌,330004;3.江西省人民醫院普外科,江西南昌 330006;4.江西省人民醫院干細胞重點實驗室,江西南昌 330006;5.江西省人民醫院神經內科,江西南昌 330006;6.南昌大學轉化醫學研究院,江西南昌, 330031)

目的探討成蛋白樣3型蛋白(FMNL3)基因轉染對結直腸癌SW480細胞上皮-間質轉化(EMT)和體外侵襲能力的影響?方法 將帶綠色熒光蛋白的重組FMNL3表達質粒pEGFP-N1/FMNL3轉染至SW480細胞中(以未轉染質粒的SW480細胞作正常對照,轉染空載質粒的SW480細胞為陰性對照),熒光定量PCR(RT-qPCR)和 Western blot法檢測重組質粒轉染前?后細胞FMNL3mRNA和蛋白的表達變化;在熒光顯微鏡下觀察FMNL3轉染前?后SW480細胞的形態變化;采用RT-qPCR和Western blot檢測轉染前?后SW480細胞EMT上皮標志物E-cadherin和間質標志物Vimentin的表達變化;用Transwell小室實驗檢測FMNL3基因轉染對SW480細胞的體外侵襲能力的影響?結果FMNL3轉染48h后SW480細胞中FMNL3mRNA和蛋白表達水平明顯提高(P0.01);FMNL3蛋白表達于細胞質中,轉染FMNL3基因后SW480細胞的形態發生了明顯的改變,由典型的圓形?多邊形變成梭形并伸出多個細長突起的間充質樣,呈現典型的EMT形態學改變;轉染FMNL3基因后,SW480細胞中EMT上皮標志物E-cadherin表達下調,間質標志物Vimentin表達上調;轉染FMNL3基因后SW480細胞的體外侵襲能力顯著增強?結論FMNL3基因可能通過促進結直腸癌細胞EMT而促進其侵襲?

結直腸腫瘤;成蛋白樣3型蛋白;上皮-間質轉化;侵襲

轉移是導致結直腸癌患者死亡的主要原因?已有研究發現上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)在腫瘤細胞侵襲和轉移中起重要作用[1]?因此,對結直腸癌EMT發生機制的研究,將有助于揭示結直腸癌侵襲?轉移的調控機制,并可能為結直腸癌治療靶點的尋找提供堅實的理論依據?新近發現的成蛋白樣3型蛋白(formin-like,FMNL3)屬Diaphanous相關成蛋白(Diaphanous-related formins,DRFs)家族成員,該家族蛋白是目前發現的一類最有效的細胞骨架裝配和組建的關鍵調控分子,其在腫瘤轉移中的作用已引起人們的廣泛重視[2]?目前有關FMNL3的表達和功能學研究文獻甚少,其是否與結直腸癌EMT和侵襲?轉移相關尚少見文獻報道?因此,本課題將初步探討FMNL3基因轉染對結直腸癌SW480細胞EMT及體外侵襲能力的影響?

1 材料與方法

1.1 材料 (1)細胞株和質粒:結直腸癌細胞株SW480及pEGFP-N1質粒為江西省人民醫院中心實驗室自存;自行構建FMNL3重組表達質粒 pEGFP-N1/FMNL3;Transwell小室(8μm孔徑)購自 Corning公司?(2)主要試劑:LipofectamineTM2000?各種引物購自Invitrogen公司;災光定量PCR(RT-qPCR)試劑盒購自TOYOBO公司;蛋白提取試劑盒購自南京凱基公司;BCA蛋白定量試劑盒和化學發光液購自碧云天公司;鼠抗人FMNL3一抗購自Abnova公司,兔抗人E-cadherin和Vimentin一抗購自CST公司,羊抗兔二抗購自中杉金橋公司?

1.2 方法

1.2.1 基因轉染實驗 自行構建FMNL3重組表達質粒pEGFP-N1/FMNL3,經鑒定正確后將其轉染SW480細胞?轉染前24h將細胞接種于24孔板中,待細胞生長至90%～95%匯合時進行基因轉染實驗:用50μL的Opti-MEM稀釋1μg重組質粒并混勻;取2μL的LipofectamineTM2000用50μL的Opti-MEM稀釋并混勻;室溫孵育5min后將兩液混勻;室溫孵育20min后均勻加入SW480細胞培養孔中,培養6h后換完全培養液?實驗組轉染FMNL3重組質粒(SW480/FMNL3組),陰性對照組轉染空載質粒(SW480/mock組),正常對照組未進行質粒轉染(SW480/NC組)?

1.2.2 RT-qPCR及 Western blot法檢測重組質粒轉染細胞后FMNL3的表達 轉染后48h收集細胞,用TRIZol試劑按說明書提取細胞總RNA,然后進行RT-qPCR反應?采用Prime 5.0自行設計并由Invitrogen公司合成,FMNL3的RT-qPCR檢測引物如下,上游引物:5′-TCC GAT TCA TTC GTT CTT AC-3′,下游引物:5′CCG CCT CAA CTC TGC TAT T-3′,產物長度173bp;GAPDH 內參引物如下,上游引物:5′-ACG GAT TTG GTC GTA TTG GGC G-3′,下游引物:5′-CTC CTG GAA GAT GGT GAT GG-3′,產物長度138bp?應用IBM7500定量PCR儀進行RT-qPCR實驗,反應條件為95℃預變性30s?95℃變性5s?55～60℃退火30s,45個循環?定量的方法參照文獻[3],用Folds=2-△△Ct表示實驗組與對照組目的基因表達的倍比關系,公式如下△△Ct=(Ct目的基因-CtGAPDH)實驗組-(Ct目的基因-CtGAPDH)對照組?實驗重復3次,計算平均值?用南京凱基公司的蛋白提取試劑盒抽提各組細胞總蛋白,BCA法定量蛋白?取細胞總蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),轉到PVDF膜,5%脫脂奶粉室溫封閉1h,FMNL3-抗(1∶500)4℃孵育過夜,二抗(1∶500)室溫1h,用化學發光液在暗室內顯影?曝光成像?

1.2.3 FMNL3基因轉染前?后SW480細胞形態檢測 因重組質粒含有編碼綠色熒光蛋白EGFP的基因,轉染細胞后能發出綠色熒光,轉染48h后可在倒置熒光顯微鏡下觀察SW480細胞的形態學變化?

1.2.4 FMNL3基因轉染前?后SW480細胞的體外侵襲能力變化 實驗前將Transwell小室濾膜按每孔50μL包被Matrigel膠并在培養箱中聚合2h,消化細胞并用無血清的RPMI-1640培養液重懸,調整細胞濃度至1×105/mL后,將細胞接種于上室,下室用常規培養基作趨化因子,培養24h后取出濾膜,4%多聚甲醛固定?Gimsa染色,光鏡下隨機挑取5個視野計數穿膜細胞數,取其均值代表浸潤力量值?

1.2.5 RT-qPCR及 Western blot法檢測細胞中EMT上皮及間質標志物的表達 方法步驟同1.2.2,其中 Anti-E-Caherin和Anti-Vimentin均1∶1 000?

1.3 統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件進行分析,計量資料用±s表示,RT-qPCR?Western blot及體外侵襲實驗結果均采用單因素方差分析?以P0.05為差異有統計學意義?

2 結 果

2.1 重組表達質粒pEGFP-N1/FMNL3轉染SW480細胞后FMNL3表達水平 FMNL3重組表達質粒pEGFP-N1/FMNL3經雙酶切及測序鑒定證實序列完全正確,說明FMNL3表達載體構建成功?轉染SW480細胞48h后FMNL3mRNA表達水平提高約53.47倍(P0.01),蛋白表達約8倍(圖1),說明FMNL3已經成功轉染入SW480細胞中?

圖1 3組SW480細胞中E-Cadherin和Vimentin蛋白表達水平比較

2.2 FMNL3基因轉染前?后SW480細胞形態觀察 倒置熒光顯微鏡下觀察FMNL3轉染前?后SW480細胞的形態,結果顯示,FMNL3蛋白表達于細胞質;FMNL3轉染后SW480細胞形態變化顯著,由典型的圓形?多邊形變成梭形并伸出多個突起的間充質細胞樣(圖2),呈現出典型的EMT形態學改變?

2.3 EMT上皮及間質標志物的表達變化 RT-qPCR及Western blot法檢測結果顯示,與SW480/NC組比較,SW480/FMNL3組細胞E-cadherin mRNA表達水平下調55%,而Vimentin的mRNA表達上調15.47倍,其蛋白表達變化趨勢與mRNA水平的表達變化一致?

圖2 倒置熒光顯微鏡下觀察3組SW480細胞的形態學改變(×200)

圖3 顯微鏡下觀察3組SW480細胞的體外侵襲能力(×200)

2.4 FMNL3基因轉染前?后SW480細胞的體外侵襲能力變化 Transwell體外侵襲實驗觀察到,48h后各組細胞均已穿出微 孔 濾 膜 (圖 3?4),SW480/NC 組?SW480/mock 組?SW480/FMNL3組顯微鏡下計數穿膜細胞數分別為(125.78±20.12)個?(125.46±16.59)個?(164.78±23.37)個,FMNL3轉染后SW480細胞的體外侵襲能力顯著增強(P0.05)?

圖4 3組SW480細胞的體外侵襲能力變化統計圖形

3 討 論

FMNL3基因編碼產物屬DRFs家族成員,該家族是一類細胞中普遍存在?高度保守的多功能蛋白家族,通過其保守的FH2結構域促進肌動蛋白單體聚合并加快肌動蛋白纖維延伸,是目前發現的細胞中最有效的肌動蛋白成核因子之一[4];作為細胞骨架組建和裝配的關鍵調控分子,其參與了眾多以肌動蛋白為基礎的生命過程,包括細胞質分裂?細胞極性和運動?偽足形成等[5-6]?目前研究已經發現,該家族與Rho細胞運動信號通路相關,通過調控細胞骨架如絲狀偽足?板層偽足等的形成而影響腫瘤細胞的運動?侵襲和轉移能力[2]?

FMNL3是新近發現的基因[7],位于染色體12q13?目前有關其表達和功能學研究文獻甚少,生物信息學分析顯示其在脾臟?卵巢纖維瘤?橫紋肌肉瘤?胃癌中表達[7];有研究發現在體內高運動能力的黑色素細胞亞群中存在FMNL3的高表達[8];FMNL3調控肌動蛋白的成核和延伸[9],與血管形成過程中內皮細胞的細胞骨架重組有關[10],并能促進細胞骨架絲狀偽足的形成[11],FMNL3依賴RhoC誘導前列腺癌細胞遷移[12-13];但FMNL3是否與結直腸癌EMT相關目前還少見文獻報道?本課題前期研究中用免疫組織化學和RT-qPCR法檢測結直腸癌組織和多個細胞系中FMNL3?EMT上皮和間質標志物的表達發現,FMNL3在結直腸癌原發灶組織中的表達高于對應癌旁正常組織,在淋巴結轉移灶組織中的表達高于其原發灶組織[14];同時發現FMNL3的表達與EMT上皮標志物的表達呈負相關,而與間質標志物呈正相關;FMNL3及間質標記物Vimentin在高轉移潛能細胞系(SW620和LOVO)中的表達高于其在低轉移潛能細胞系(SW480和HT29)中的表達,而上皮標記物的表達趨勢正好相反[15];這提示FMNL3可能與結直腸癌EMT相關?在本研究中也發現,轉染FMNL3基因后SW480細胞的形態發生明顯變化,由圓形或多邊形變為梭形并伸出多個細長突起的間充質樣,呈現典型的EMT形態學改變;并且不論mRNA水平還是蛋白水平,與SW480/Mock組細胞相比,SW480/FMNL3組細胞中上皮標志物E-cadherin表達均降低,間質標志物Vimentin表達均升高,這進一步說明FMNL3可能促進結直腸癌細胞EMT,與本課題的前期研究結果相吻合;同時還發現,轉染FMNL3基因后SW480細胞的體外侵襲能力顯著增強,說明在體外FMNL3能夠促進結直腸癌細胞侵襲?綜合以上研究結果,本研究認為FMNL3可能通過促進結直腸癌細胞EMT而促進結直腸癌侵襲,但具體的分子機制還有待進一步深入研究?

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Influence of FMNL3 gene transfection on epithelial-mesenchymal transition and in vitro invasion potential of colorectal carcinoma SW480 cells*

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(1.,,, 330006,;2.,,,, 330004,;3.,,, 330006,;4.,,, 330006,;5.,,, 330006,;6.,,, 330031,)

ObjectiveTo investigate the impact of FMNL3gene transfection on the epithelial-mesenchymal transition(EMT)and the in vitro invasive potential of colorectal carcinoma SW480cells.MethodsThe recombination FMNL3expression plasmid with EGFP was transfected into SW480cells(SW480cells without transfected plasmid as the normal control group and SW480cells with empty vector as the negative control group).The changes of FMNL3mRNA and protein expression were detected by real-time PCR and Western blot after transfection of 48hwith recombination FMNL3expression plasmid.The changes of SW480cell morphology were detected by the fluorescence microscope after FMNL3transfection.The changes of EMT epithelial and mesenchymal markers in SW480cells were detected by real-time PCR and Western blot after FMNL3transfection.The Transwell chamber invasion assay in vitro was used to investigate the effects of FMNL3gene trasfection on the invasive potential of SW480cells.ResultsThe levels of FMNL3mRNA and the protein expression were significantly increased at 48hafter transfection with recombination FMNL3expression plasmid(P0.01);the FMNL3protein was expressed within cytoplasma,the morphology of SW480cells after FMNL3transfection showed significantly changes from round and polygon to spindle and stretched out the multiple long and thin prominences as mesenchyma,which appeared the typical EMT change;after FMNL3gene transfection,the expression of EMT epithelial marker E-cadherin was down-regulated and the expression of mesenchymal marker Vimentin was up-regulated in SW480 cells;the in vitro invasive potential of SW480cells was remarkably enhanced after FMNL3transfection.ConclusionFMNL3gene may promote its invasion by promoting EMT of colorectal carcinoma.

colorectal cancer;FMNL3;epithelial-mesenchymal transition;invasion

* 基金項目:國家自然科學基金資助項目(81201972?81260327)?

曾元鳳(1974-),主治醫師,博士后在站工作人員,主要從事結直腸癌轉移的分子機制研究?△

,Tel:(0791)8895633;E-mail:wuxm@163.com?▲通訊作者,Tel:(0791)83827168;E-mail:hongboxin@yahoo.com?

10.3969/j.issn.1671-8348.2014.12.018

A

1671-8348(2014)12-1460-03

2013-10-20

2013-12-05)

論著?臨床研究