運動訓練對SHR／SP大鼠VD模型認知功能及海馬ChAT、AchE活性的影響＊

曾貴剛，張 申，顧堅忠，陳國強，魏品康△

（1.第二軍醫大學附屬上海長征醫院中醫理療科，上海 200003；2.中國科學院上海實驗動物中心，上海 201615；3.上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，上海 201203）

運動訓練對SHR／SP大鼠VD模型認知功能及海馬ChAT、AchE活性的影響＊

曾貴剛1，張 申1，顧堅忠2，陳國強3，魏品康1△

（1.第二軍醫大學附屬上海長征醫院中醫理療科，上海 200003；2.中國科學院上海實驗動物中心，上海 201615；3.上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，上海 201203）

目的觀察運動訓練對自發性高血壓腦卒中傾向大鼠（SHR／SP）血管性癡呆（VD）模型認知能力及ChAT、AchE活性的影響。方法將雄性SHR／SP大鼠30只，分為假手術組、模型組、運動組，每組各10只，采用分次結扎2-VO法制作VD模型，假手術組、模型組術后正常飼養不做干預；運動組術后采用跑臺訓練（DSPT-1）8周，訓練完成后采用Morris水迷宮檢測各組大鼠認知功能，最后處死大鼠取材檢測海馬膽堿乙酰轉移酶（ChAT）及乙酰膽堿酯酶（AchE）活性。結果在定位航行訓練中，假手術組大鼠潛伏期明顯少于運動組和模型組大鼠，但運動組大鼠潛伏期明顯短于模型組大鼠（P＜0.05）；在空間探索實驗中，假手術組大鼠跨越原平臺次數明顯多于其他兩組大鼠，運動組大鼠跨越原平臺次數明顯多于模型組（P＜0.05）；運動訓練可增加海馬ChAT活性及降低AchE活性。結論運動訓練可改善SHR／SP大鼠VD模型海馬膽堿能系統的功能，進而提高認知能力。

癡呆，血管性；卒中；大鼠，近交SHR；運動；膽堿乙酰轉移酶；乙酰膽堿酯酶

血管性癡呆（vascular dementia，VD）是指由腦血管病引起的認知功能障礙，尤其是學習記憶功能的減退，不僅影響患者的生活質量，而且造成巨大的社會和家庭負擔。相關流行病學報道指出，VD的危險因素主要有高血壓、糖尿病、高脂血癥等［1－2］。因此，采用一種理想的、接近臨床 VD病因、病理的動物模型進行相關研究，將更加真實地模擬VD發病過程。本課題組前期采用自發性高血壓腦卒中傾向大鼠（stroke prone spontaneously hypertensive rat，SHR／SP）制作 VD模型，較好地反映了持續高血壓基礎上產生的VD的特征［3］，本研究擬采用運動訓練干預前期制作的SHR／SP大鼠VD模型，觀察其對認知功能、海馬膽堿乙酰轉移酶（choline acetyltransferase，ChAT）及乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesteras，AchE）的影響，并探討相關可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 選用清潔級SHR／SP大鼠30只，鼠齡4個月，體質量350～400g，由上海中科院實驗動物中心提供［SCXK（滬）2007-0005］，采用尾套法測量備選剔除血壓低于180mm Hg的SHR／SP大鼠。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及手術方法 實驗動物共分為3組，分別為假手術組、模型組和運動組，采用分次結扎2-VO法制作VD模型［4］，具體操作如下：（1）模型組和運動組，1%戊巴比妥鈉（3mL／kg）腹腔注射麻醉后將大鼠仰臥位固定于手術臺，頸部皮膚剪毛備皮，聚維酮碘及乙醇常規消毒。切口位于頸正中線右側旁開0.5cm處，長約1cm。鈍性分離皮下組織后，于切口正下方的斜方肌與氣管夾角處可見右側頸總動脈搏動。分離出右側頸總動脈后，以4號絲線雙重結扎。術中動作輕柔，避免鉗夾和過分牽拉迷走神經，注意無菌原則，結扎后分層縫合。術后1周，于頸正中線左側旁開0.5cm處切開，分離并雙重結扎左側頸總動脈，其余操作同前。（2）假手術組，雙側頸總動脈不結扎，其余同上。造模后選取存活大鼠，每組各10只。

表1 各組大鼠平均逃避潛伏期比較（±s，n＝10，s）

表1 各組大鼠平均逃避潛伏期比較（±s，n＝10，s）

a：P＜0.05，b：P＜0.01，與假手術組比較；c：P＜0.05，與運動組相比。

組別 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天假手術組 69.40±15.88 26.47±11.32 20.10±6.89 17.51±5.69 17.47±3.56運動組 66.80±14.17 39.44±9.73a 29.39±6.31a 24.06±4.49a 22.40±4.38a模型組 67.19±17.39 52.24±16.34bc 46.90±16.04bc 35.99±15.03bc 31.41±12.73bc

1.2.2 術后處理 假手術組、模型組術后正常飼養不做干預。運動組大鼠采用多通道電動跑臺訓練（DSPT-1），大鼠在手術前均經過適應性訓練3d，每次10min，在術后24h開始予以正式訓練，每天30min，每周5d，連續8周。跑臺參數設置如下：平板斜度為0度；履帶傳輸速度術后第1～2天5m／min，術后第3～5天8m／min，第5天后12m／min，連續訓練8周。所有運動訓練均在動物暗周期18：00～22：00完成。

1.2.3 行為學檢測方法 8周后采用 Morris水迷宮（上海吉量軟件科技有限公司提供，Morris水迷宮視頻分析系統）對3組大鼠進行檢測，實驗過程中保持水溫25℃，保持環境安靜及光線恒定，并于水迷宮4個象限設置不同參照物，實驗者應避免經常變換位置。Morris水迷宮檢測分為兩部分進行：（1）定位航行實驗。實驗前1d讓大鼠于迷宮內進行自由適應性游泳2min，從第1天起，每天分上、下午各訓練2次。訓練時隨機選擇一個非平臺所在象限入水點，將大鼠面向池壁放入水中，系統自動記錄大鼠尋找并爬上平臺時所需時間（逃避潛伏期）及運動軌跡，每次訓練間隔為120s。如果大鼠在120s內未找到平臺，須將其引至平臺站立10s，潛伏期計為120s，每天4次潛伏期的算術平均值作為這一時間段的學習成績。每次訓練后用毛巾擦干大鼠，單獨置于鼠籠內5min后再移入同組鼠籠。（2）空間搜索實驗。于第5天最后1次訓練后撤除水下平臺，在同一入水點將大鼠面向池壁放入水中，系統自動記錄其在120s內跨過原平臺相應位置的次數及運動軌跡，計算大鼠在水池目標象限區游泳時間占游泳總時間的百分比，并將其作為評價大鼠學習記憶成績的指標。

1.2.4 ChAT和AChE活性測定 Morris水迷宮檢測結束后將3組大鼠快速斷頭，取出全腦置于冰盒上迅速分離海馬并稱重，按照質量1∶9的比例加入4℃生理鹽水制備10%勻漿，將勻漿液置于離心機3 000r／min離心20min，取上清液，按ChAT檢測試劑盒、AchE檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所提供）說明書上具體步驟測定ChAT和AchE活性。

1.3 統計學處理 所有數據采用SAS8.0統計軟件進行分析，計量資料采用±s表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠定位航行實驗結果比較 各組大鼠在水迷宮定位航行訓練中，尋找平臺的平均逃避潛伏期均有顯著改善，一般隨著訓練次數的增加，其潛伏期均有不同程度的縮短。假手術組大鼠在訓練后第3天趨于平穩，運動組、模型組大鼠在訓練后第4天起趨于平穩。假手術組大鼠潛伏期明顯少于運動組和模型組（P＜0.05），運動組大鼠潛伏期明顯短于模型組（P＜0.05），見表1。

2.2 各組大鼠空間探索實驗結果比較 定位航行訓練完成后移除平臺，各組大鼠依記憶尋找原平臺，假手術組大鼠120s跨越原平臺次數明顯多于其他兩組大鼠（P＜0.05），運動組大鼠120s跨越原平臺次數明顯多于模型組大鼠（P＜0.05）。各組大鼠在目標平臺象限探索時間百分比和跨越原平臺次數，見表2。各組大鼠在空間探索實驗中的游泳軌跡，見圖1。

表2 各組大鼠空間探索實驗結果比較（±s，n＝10）

表2 各組大鼠空間探索實驗結果比較（±s，n＝10）

a：P＜0.05，b：P＜0.01，與假手術組比較；c：P＜0.05，與運動組比較。

組別 時間百分比（%） 穿越次數（次）假手術組37.05±4.63 3.18±1.94運動組 34.38±7.50a 2.63±0.73a模型組 25.17±6.18bc 1.11±0.76bc

圖1 各組大鼠在空間探索實驗中的游泳軌跡

2.3 各組大鼠ChAT和AchE水平比較 模型組大鼠海馬ChAT活性較假手術組大鼠低，而AchE活性較假手術組大鼠高（P＜0.01），運動組大鼠較模型組海馬中ChAT活性升高、AchE活性降低（P＜0.05），見表3。

表3 各組大鼠ChAT和AchE水平比較（±s，n＝10）

表3 各組大鼠ChAT和AchE水平比較（±s，n＝10）

a：P＜0.01，與假手術組比較；b：P＜0.05，c：P＜0.01，與運動組比較。

組別 ChAT（U／g） AchE（U／mg）假手術組148.84±7.33 0.55±0.05運動組 104.96±9.75a 0.70±0.04a模型組 94.90±7.60ab 0.81±0.05ac

3 討 論

SHR／SP大鼠作為研究原發性高血壓的重要動物模型，在出生后幾個月內能夠自行發展成為穩定的高血壓，同時伴有腦組織等高血壓相關靶器官的損傷［5］。腦組織損傷涉及不同層次的多個腦區，如腦血管、血腦屏障、海馬CA1區、紋狀體、齒狀回等均可出現多種病理改變，且隨高血壓程度的不斷加深而加重，最終表現為認知功能損傷。腦血管因素與長期高血壓常常合并產生VD，共同導致認知功能缺損。以往研究多以正常大鼠為基礎制作VD模型，反映了持續低灌流對大腦的損害，但不能模擬在長期高血壓基礎上大腦持續低灌流所產生的VD，SHR／SP大鼠可以很好地模擬長期高血壓與持續低灌流兩種因素共同導致的VD，與臨床長期高血壓后卒中導致的VD病例有很高的相似度［6］。

海馬是學習、記憶的高級神經活動中樞，海馬膽堿能神經元損傷是認知功能受損的形態學基礎，海馬乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）的水平與記憶功能密切相關［7－8］。海馬組織中的Ach存在于膽堿能神經元囊泡中，Ach由膽堿在ChAT的催化下合成，由囊泡釋放后立刻被AchE水解。ChAT與AchE共同維持著Ach的動態平衡。海馬組織對缺血極為敏感，缺血會損壞海馬組織中的膽堿能神經元，釋放Ach并被AchE分解，腦內Ach水平降低，大鼠的學習記憶能力隨之下降。由于Ach性質不穩定容易水解，直接準確測定其水平比較困難，而ChAT與AchE便于檢測，且與Ach代謝密切相關。因此，通過檢測ChAT與AchE即可判斷腦內Ach水平的變化［9］。

在本研究中，模型組大鼠較假手術組大鼠海馬AchE活性升高，而ChAT活性降低，提示膽堿能神經元損傷，這與以往研究證實SHR／SP大鼠VD模型大腦皮質、海馬和腦脊液中的Ach水平明顯下降一致［10］。運動訓練與中樞神經系統內膽堿能系統密切相關：踏板跑能使大鼠海馬Ach釋放增加；長期適量運動能提高海馬與皮質內膽堿能纖維密度［11］；運動訓練可促使大鼠海馬ChAT mRNA表達的上調和AchE mRNA表達的下調［12］。本實驗結果也證實通過運動訓練可以抑制SHR／SP大鼠VD模型海馬AchE活性，提高ChAT活性，改善膽堿能系統的功能，進而增加海馬Ach水平，從而改善SHR／SP大鼠VD模型的認知能力。

目前尚無治療和預防VD的特效藥物，臨床用藥也以減緩認知功能減退的進程，提高患者生存質量等對癥治療為主。膽堿酯酶抑制劑近年來成為VD治療的主要用藥之一［13］，但患者需長期服藥，容易出現惡心、食欲下降等胃腸道反應，導致耐受性較差［14］，藥物治療VD僅能在一定程度上延緩認知功能的減退，不能改變癡呆的進程，因而對VD血管性危險因素的預防，仍然是VD根本的防治措施［15］。

運動訓練可對抗VD認知功能缺損，增加大腦的“認知功能儲備”［16］，且作為一種積極主動的治療方法，幾乎無不良反應，因而成為近年來VD治療的熱點。適宜的運動訓練能夠協助改善海馬膽堿能系統的功能，調節Ach的生理代謝，進而提高VD認知能力，與相應的藥物協同治療VD，可減少藥物用量及相關不良反應。同時，運動訓練可通過改變SHR大鼠的血流動力學、血管的彈性、降低交感神經的活性、改善內皮功能、改善血管順應性等機制降低血壓［17－20］，不僅能降低高血壓危險因素，而且能直接降低血壓，尤其適宜作為長期高血壓基礎上所產生VD的非藥物治療手段。

綜上所述，運動訓練可通過改善SHR／SP大鼠VD模型膽堿能系統的功能，提高海馬Ach水平，促進認知能力恢復，為高血壓基礎上產生的VD治療提供了一種新的思路，但由于高血壓基礎上產生VD是一個長期復雜的過程，運動訓練的最佳強度、最佳方式及其對海馬ChAT、AchE活性的影響規律還有待進一步研究。

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Effects of exercise training on cognitive function，ChAT and AchE activity in SHR／SP rat vascular dementia model＊

ZengGuigang1，ZhangShen1，GuJianzhong2，ChenGuoqiang3，WeiPinkang1△
（1.DepartmentofTraditionalChineseMedicinePhysiotherapy，AffiliatedChangzhengHospital，SecondMilitaryMedicalUniversity，Shanghai200003，China；2ShanghaiLaboratoryAnimalCenter，ChineseAcademyofSciences，Shanghai201615，China；3.ShanghaiXipuer-Bikai LaboratoryAnimalCo.，Ltd.，Shanghai201203，China）

ObjectiveTo investigate the effects of the exercise training on the cognitive function，choline acetyltransferase（ChAT）activity and acetylcholinesterase（AchE）activity in stroke prone spontaneously hypertensive rat（SHR／SP）vascular dementia model.Methods30male SHR／SP rats were randomly divided into sham operation group，model group and exercise group（n＝10）.The VD model was established by the fractional ligation of bilateral carotid artery（2-VO）.The sham operation group and the model group were given the normal feeding without intervention after operation；the exercise group adopted the treadmill exercise（DSPT-1）for 8weeks.After the exercise，the Morris maze test was conducted for evaluating the cognitive function in each group.The rats were finally killed for detecting the ChAT activity and AchE activity of hippocampus.ResultsIn the positioning navigation training，the latency period of the sham operation group was significantly short than that of the exercise group and the model group，but the latency period of the exercise group was obviously short than that of rats in the model group（P＜0.05）；in the spatial exploration test，the rats in the sham operation group had more frequency of crossing platform than the other two groups，the exercise group had more frequency of crossing platform in platform quadrant than the model group（P＜0.05）；the exercise training could increase the ChAT activity and lower the AchE activity of hippocampus.ConclusionThe exercise training can improve the function of hippocampal cholinergic system in SHR／SP and then increase the cognitive ability.

dementia，vascular；stroke；rats，inbred SHR；exercise；choline acetyltransferase；acetylcholinesterase

10.3969／j.issn.1671-8348.2014.11.019

A

1671-8348（2014）11-1335-03

上海市科學技術委員會科研計劃資助項目（09140902100）。

曾貴剛（1982－），主治醫生，在讀博士研究生，主要從事中西醫結合康復研究。△

，Tel：（021）81885476；E-mail：cczyk＠smmu.edu.cn。

2013-09-14

2014-01-02）

論著·臨床研究