肝母細胞瘤中的干細胞表面標記物的初步識別＊

張守華，肖菊花，鄧慶強，徐紅艷，羅 鳴，諶衛龍，雷 俊，陶 強△

（1.江西省兒童醫院普外科，南昌 330006；2.江西省婦幼保健院超聲診斷科，江西南昌 330006）

肝母細胞瘤中的干細胞表面標記物的初步識別＊

張守華1，肖菊花2，鄧慶強1，徐紅艷1，羅 鳴1，諶衛龍1，雷 俊1，陶 強1△

（1.江西省兒童醫院普外科，南昌 330006；2.江西省婦幼保健院超聲診斷科，江西南昌 330006）

目的初步篩選出肝母細胞瘤（HB）中的腫瘤干細胞（NSC）相關表面標記組合，并了解NSC的分布。方法選擇入住江西省兒童醫院并接受手術的HB患兒，采用免疫組織化學染色的方法，觀察干細胞相關標記物CD34、Thy-1、c-kit、CD56和干細胞生長因子（SCF），在HB組織及距腫瘤組織邊緣3cm以外的正常肝臟組織的表達和分布。結果Thy-1、c-kit散在分布于HB組織中，主要集中在匯管區，而正常肝臟組織中不表達；CD34及SCF在HB中的表達明顯高于正常肝臟組織（P＜0.05），其中CD34主要在血管內皮系統中分布，SCF主要表達在匯管區；CD56表達于成簇的神經纖維組織中，在HB及正常肝臟組織中表達差異無統計學意義（P＞0.05）。結論不同干細胞相關表面標志物分布于HB組織中，并且集中表達在特定區域。表達Thy-1／c-kit陽性細胞可能對HB的發生起一定作用。

腫瘤干細胞；肝母細胞瘤；抗原，CD34；抗原，Thy-1；原癌基因蛋白質c-kit

腫瘤干細胞（neoplastic stem cells，NSC）的存在已在許多腫瘤細胞株及原發性腫瘤中得到了證實。NSC學說認為，腫瘤組織由異質性的細胞組成，其中有極少部分細胞亞群具有起始腫瘤的能力，它們雖然數量極少，卻在腫瘤發生、轉移和復發中起重要作用。目前如白血病、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌、結腸癌、卵巢癌等中均證實了NSC的存在［1］，可是肝母細胞瘤（hepatocastoma，HB）的NSC卻一直未能確定，而篩選出合適的表面標記組合是有效分離和鑒定NSC的前提。本文旨在初步探討HB的NSC相關表面標記物存在的合理性，為后續的NSC標記物分離和確定提供依據和參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2002～2012年江西省兒童醫院普外科收治的HB患兒8例（腫瘤組），其中男5例，女3例，年齡15d～10歲，平均發病年齡為19.8個月，術前未經放療、化療，8例患兒均手術完整切除并經病理檢查診斷為HB，根據病理分型，其中上皮型4例，混合型4例。取距腫瘤組織邊緣3cm以外的正常肝臟組織作為對照組。

1.2 方法 標本組織離體后立即取材，并以4% 多聚甲醛固定，常規石蠟包埋，4μm切片。石蠟包埋組織切片經常規脫蠟至水，3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶，山羊血清封閉，抗原修復，然后采用常規SP免疫組織化學方法檢測CD34、Thy1、c-kit以及干細胞生長因子（SCF）和CD56的蛋白表達情況。由兩位病理科醫生獨立閱片，在光學顯微鏡下觀察陽性細胞的分布特征。以出現棕黃色、高出背景色者為陽性細胞。選取具有代表性的腫瘤區域，在高倍鏡下（×400）隨機選取10個視野，記錄陽性細胞占組織細胞的百分率。

1.3 統計學處理 采用SPSS15.0統計軟件對數據進行統計分析，計量資料用±s表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

本文8例患兒 HB組織中均可見到表達CD34、Thy-1、ckit、SCF和CD56陽性細胞，其中Thy1、c-kit散在分布于腫瘤組織，主要集中在匯管區（圖1A、B），而在正常肝臟組織中不表達（圖1C）；CD34主要表達于血管內皮系統，HB組織中的表達明顯高于正常肝臟組織（圖1D、E，P＜0.05）；SCF陽性細胞主要分布于匯管區，HB中的表達明顯高于正常肝臟組織（圖1F、G，P＜0.05）；CD56表達于成簇的神經纖維組織中，二者表達差異無統計學意義（圖1H，P＞0.05）。兩組CD34、SCF和CD56的表達比較，見表1。

圖1 HB及正常肝臟組織中相關標記物表達（×400）

表1 兩組CD34、SCF等表達比較（±s，n＝8）

表1 兩組CD34、SCF等表達比較（±s，n＝8）

組別0.32±0.09 0.43±0.09 0.11±0.04對照組 0.17±0.07 0.11±0.04 0.09±0.09 P＜0.01 ＜0.01 ＞0.05 CD34 SCF CD56腫瘤組

3 討 論

HB是小兒最常見的肝臟原發性惡性腫瘤，在小兒惡性實體性腫瘤中，HB發病率僅次于腎母細胞瘤和神經母細胞瘤，位于第3位［2］。兒童HB是一種胚胎性腫瘤，其有未成熟的胚胎性組織，這些組織持續增生，形成發育幼稚的組織塊而可能轉化成惡性的母細胞瘤。HB病理組織學上可分為上皮型及混合型［3］。上皮型又分為4個亞型：胎兒性、胚胎型、巨梁型、小細胞未分化型。HB明確的發病機制尚未完全明了，有學者認為可能與染色體異常、低出生體質量、母體妊娠期不良外界因素等有關。HB的預后不容樂觀，特別是在中國，由于患兒就診較晚，手術完整切除率低，治療不規范，3年生存率小于50%［4］。但近年NSC理論的出現在一定程度上為HB的發病機制、治療和預后提供了新的視角。該理論認為，NSC是存在于腫瘤細胞中的一個亞群，具有高度自我更新及無限增殖能力，呈不對稱分裂，大量事實證實其與腫瘤發生、侵襲、轉移、復發及耐藥密切相關。許多腫瘤如乳腺癌、前列腺癌等，均分離出了NSC，但HB的NSC表面標記物一直未能確定。

卵圓細胞是人們目前公認的肝組織中的肝源性肝干細胞，是肝內膽管系統源性的多潛能分化細胞群，可以分化為膽管上皮細胞和肝細胞［5］。OV6、SCF、c-kit、CK-8、CD34、CD49、Thy－1、AFP等被認為是卵圓細胞表達相對較高的標志物，其某些標志物可以作為今后肝NSC篩選的參考標志物。本研究基于此前對肝臟干細胞的研究，結合文獻［6-7］報道，初步設想HB的NSC相關幾個表面標記物并驗證其合理性。本研究采用免疫組織化學染色的方法，觀察表達CD34、Thy1、c-kit、SCF和CD56的陽性細胞在HB組織及正常肝臟組織的表達情況和分布，結果發現，Thy-1、c-kit散在分布于 HB組織，主要集中在匯管區，而正常肝臟組織中表達為陰性。Thy-1是相對分子質量為25～37×103的細胞表面糖蛋白，通過二酰甘油（DAG）錨定于糖基磷脂酰肌醇（GPI）的C末端而附著在細胞膜的胞漿面，參與細胞的分化、識別、遷徙等功能。人類許多實體瘤細胞（包括腦瘤、皮膚癌）中都有Thy-1的表達，廣泛分布于許多惡性腫瘤中。有研究表明在某些腫瘤如肝癌、肺癌等組織中，其表達情況與病理類型、腫瘤轉移以及預后密切相關。Yang等［8］從肝癌細胞株和肝癌組織中篩選出Thy-1陽性細胞，異種移植入重癥復合型免疫缺陷病小鼠體內，發現其有致瘤性，病理提示符合肝細胞肝癌的診斷，進一步指出Thy-1陽性肝癌細胞具有自我更新、多向分化和高致瘤性等生物學特性，是肝癌干細胞的特異性標志物。c-kit基因位于人染色體4q12-13，屬于原癌基因，其產物是Ⅲ型酪氨酸激酶，編碼145×103的跨膜糖蛋白，c-kit受體分布于細胞表面，結構類似于粒－巨核細胞集落刺激因子（GM-CSF）和血小板源生長因子受體（PDGFR）［9］。c-kit與其配體結合后，誘導其胞外區的構象發生變化，使受體在細胞膜上遷移、聚集，形成二聚體，使得酪氨酸激酶磷酸化，繼而激活酪氨酸激酶功能區，細胞質內多個蛋白質持續磷酸化，這些效應分子的磷酸化促發細胞間信號的瀑布級鏈反應，調控c-kit的下游底物，包括 MAPK、Ras-Raf-MAP、JAK／STAT等多條信號傳導通路，最終活化細胞質內的轉錄因子，從而調節基因表達，控制細胞生長、增殖和分化［10］。諸如急性髓細胞白血病、肺癌、肝癌等惡性腫瘤均有c-kit的表達，有些腫瘤如胃腸道間質瘤，甚至認為c-kit是其特征性標記物［11］。c-kit基因誘導腫瘤有兩種方式，（1）c-kit基因的過表達，激活下游信號通路，引起腫瘤的過度增殖所導致；（2）c-kit基因發生突變，導致非配體依賴性的受體二聚體形成，從而激活c-kit的酪氨酸激酶活性，并持續刺激下游的信號轉導通路，引起細胞不斷的生長、增殖，最終成為腫瘤細胞［12］。結合Thy-1和ckit的特性本研究發現，其主要在HB組織的匯管區表達，而在正常肝組織中不表達或表達極少。由此，本研究推測Thy-1／ckit陽性細胞可能在HB的發生起一定作用。

SCF又稱肥大細胞生長因子，SCF可以促使處于G0期的干細胞進入細胞分裂周期，以此促進干細胞的增殖和分化。另外，SCF還可抑制細胞凋亡過程，從而提高細胞的存活力［13－14］。SCF在人體肝臟、骨髓、胎盤、睪丸和腎臟等多種組織和細胞中都有表達，特別是干細胞群體更是高表達。有研究表明，在肺癌、神經系統腫瘤、前列腺癌等均有c-kit和SCF共表達現象。CD34在血管內皮細胞均有表達，在腫瘤組織中是判斷新生血管、侵襲性、惡性程度的重要指標［15］。本實驗中發現CD34及SCF在HB組織中的表達明顯高于正常肝組織，這可能與腫瘤新生血管、惡性程度有關，與NSC的關系有待進一步研究。CD56是神經細胞黏附分子的一種糖蛋白，位于中樞和外周神經細胞及纖維膜表面，在神經系統的生長發育發揮重要作用。本實驗發現CD56均表達于HB以及正常肝臟組織中成簇的神經纖維組織，二者在數量、分布未見明顯差異。

HB是兒童最常見的肝臟原發惡性腫瘤，其最基本的治療方法是手術切除或通過化療增加可切除的HB病例數［16］。但部分病例因原發性、繼發性或多藥耐藥性而對化療不敏感，預后極差。NSC理論在一定程度上為治療提供了新的視角，鑒定和篩選HB中NSC并了解表面標記組合的相關調控機制和信號通路，對發現潛在的藥物靶點，進而為臨床治療、提高治愈率和長期存活率都具有重要意義。

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Preliminary recognition of stem cells surface markers in hepatoblastoma＊

ZhangShouhua1，XiaoJuhua2，DengQingqiang1，XuHongyan1，LuoMing1，ChenWeilong1，LeiJun1，TaoQiang1△
（1.DepartmentofGeneralSurgery，JiangxiProvincialChildren′sHospital，Nanchang，Jiangxi330006，China；
2.DepartmentofUltrasoundDiagnosis，JiangxiProvincialMaternalandChildHealthCareHospital，Nanchang，Jiangxi330006，China）

ObjectiveTo preliminarily screen the neoplastic stem cell（NSC）related surface markers combination and to understand the NSC distribution in hepatoblastoma（HB）.MethodsThe children cases of HB undergone the surgical therapy in the Jiangxi Provincial Children′s Hospital were selected.The immunohistochemical method was adopted for observing the expression and distribution of NSC-related markers CD34，Thy-1，c-kit，CD56and stem cell factor（SCF）in the HB tissue and the normal hepatic tissue away from the edge of tumor tissue 3cm outside.ResultsThy-1and c-kit were sporadically distributed in the HB tissue and mainly focued on the portal area，but did not exressed in the normal liver tissue；the expression of CD34and SCF in HB was significantly higher than that in the normal liver tissue（P＜0.05），in which CD34was mainly distributed in the endothelial system and SCF was mainly expressed in the portal area；CD56was expressed in the tissue of the clustered nerve fibers，the expression difference between them had no statistical significance（P＞0.05）.ConclusionThe different NSC related surface markers are distributed in the HB tissue and focus on the specific areas.The positive cells of Thy-1／c-kit expression may play a role in the HB occurrence.

neoplastic stem cells；hepatoblastoma；antigens，CD34；antigens，Thy-1；proto-oncogene proteins c-kit

10.3969／j.issn.1671-8348.2014.10.020

A

1671-8348（2014）10-1208-03

江西省衛生廳課題資助項目（20131137）。

張守華（1982－），主治醫師，碩士研究生，主要從事兒童腫瘤以及干細胞研究?！?/p>

，Tel：13979170606；E-mail：taoqiang＿2008＠126.com。

2013-09-18

2013-11-25）

·論 著·