GGCX（rs6738645）基因多態性與華法林穩定劑量的關系＊

劉寅強，楊百暉，夏健明，張學玉，張桂敏

（昆明醫科大學第一附屬醫院心血管外科，云南昆明 650032）

GGCX（rs6738645）基因多態性與華法林穩定劑量的關系＊

劉寅強，楊百暉，夏健明，張學玉，張桂敏

（昆明醫科大學第一附屬醫院心血管外科，云南昆明 650032）

目的探討γ谷氨酰羧化酶（GGCX）（rs6738645）基因型在中國漢族人群中的分布情況，以及其基因多態性與瓣膜置換術后華法林穩定劑量的相關性。方法采用Snapshot技術檢測228例研究對象GGCX（rs6738645）位點基因型，研究其基因型及等位基因頻率；比較其中176例瓣膜置換術患者基因多態性與華法林穩定劑量的相關性。結果228例研究對象中，GGCX（rs6738645）位點基因型 TT、GT、GG 分別為84例（36.84%）、122例（53.51%）、22例（9.65%），T和 G等位基因的頻率分別為63.60%和36.40%；176例瓣膜置換術后患者服用華法林達穩定狀態，華法林日維持劑量GG組低于TT、GT組，組間比較差異有統計學意義（P＜0.01）；基因型3組間國際標準化比值（INR）、凝血酶原時間（PT）比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。結論中國漢族人群GGCX（rs6738645）基因多態性可能是瓣膜置換術后華法林個體劑量差異的影響因素。

γ谷氨酰羧化酶；基因多態性；華法林；心臟瓣膜假體植入

華法林是目前使用最廣泛的口服抗凝藥，也是惟一被美國食品藥物管理總局（food and drug administration，FDA）批準的瓣膜置換術后口服抗凝藥物［1］。在臨床應用中，華法林治療適應證較窄，個體用藥差異較大，近年的研究認為，基因多態性是決定藥效的個體差異的主要原因［2－4］。國內外研究表明，γ谷氨酰羧化酶（gamma-glutamyl carboxylation，GGCX）基因多態性與華法林劑量個體差異密切相關［5－6］，目前中國漢族人群的相關研究較少，為了解GGCX（rs6738645）基因型及等位基因在中國漢族人群中的分布情況及其基因多態性對華法林抗凝的影響。本研究應用Snapshot技術對中國漢族人群的GGCX（rs6738645）基因多態性情況進行分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究選取228例中國漢族人群作為研究對象，在取得知情同意書后抽血提取DNA，Snapshot法檢測基因多態性。其中52例為健康體檢者；176例為瓣膜置換術患者，為2010年1月至2012年3月在昆明醫科大學第一附屬醫院心血管外科行瓣膜置換術后服用華法林抗凝治療患者，其中男82例，女94例，年齡（44.44±12.33）歲，體質量（59.19±11.03）kg，身高（1.64±0.71）cm。抗凝強度預設國際標準化比值（international normalized ratio，INR）為1.5～2.5，隨訪3～24個月；瓣膜置換術患者術后均服用華法林抗凝超過2個月，兩次復查凝血檢查INR達到抗凝預設標準，無需調整劑量，視為達到抗凝穩定狀態。記錄華法林日維持劑量，凝血酶原時間（prothrombin time，PT）、INR等指標，入選患者肝、腎功能指標無異常，且未服用影響華法林療效指標藥物。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集與DNA提取 每例患者在華法林達到穩定劑量時采集靜脈血5mL，置于枸櫞酸鈉抗凝管中作9∶1抗凝（標本1.80mL，抗凝劑0.20mL），2mL用于測定PT、INR，剩余全血3 000r／min離心10min，棄上層血漿，分裝，沉淀細胞使用基因組試劑盒快速提取基因組DNA，－20℃保存。

1.2.2 基因分型 設計引物擴增包含 GGCX（rs6738645）位點片段，引物由上海捷瑞公司合成。Taq酶、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）為Fermentas公司產品，PCR儀型號為東勝龍（EDC-810）。多重PCR反應體系含1.00μL模板 DNA，1.50μL 10×buffer緩沖液，1.50 μL MgCL2（25mmol），0.30μL dNTP，0.15μL 引物混合（20P），0.30μL Taq聚合酶，補水至15.00μL。擴增條件：95℃預變性3min；94℃變性15s，60℃退火15s，－0.5℃（每循環降溫0.5℃）11個循環；72℃延伸30s，94℃變性15s，54℃退火15s，72℃延伸30s，72℃加長延伸3min，共24個循環，擴增后取3μL PCR產物用于ExoⅠ和Sap純化，主要是去除反應產物中的引物及dNTP。37℃保持45min，80℃保持15min，純化好后進行延伸反應，預先混好延伸引物。延伸反應體系：PCR產物2.00μL，Snapshot Mix試劑1.00μL，延伸引物混合2.00μL，補水至6.00μL，96℃預變性1min，96℃變性10s，52℃退火5s30個循環。取1.00μL延伸產物，加8.00μL上樣緩沖液，95℃變性3min，立即冰水浴。測序儀型號為ABI 3730XL，研究隨機抽取10%樣本進行重復檢驗。

圖1 GGCX（rs6738645）基因型的Snapshot峰型序列分析

1.3 統計學處理 用SPSS13.0統計軟件進行數據處理，用χ2檢驗判斷等位基因頻率和基因型頻率分布是否符合Hardy－Weinberg平衡。單因素方差分析基因多態性與穩定狀態時華法林抗凝指標相關性，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 樣本基因型的判定 樣本的基因型通過Snapshot技術測序，各基因型的峰型測序結果，見圖1。

2.2 GGCX（rs6738645）等位基因和基因型分布頻率 228例研究對象中GGCX（rs6738645）位點基因型TT、GT、GG分別為84例（36.84%）、122例（53.51%）、22例（9.65%），T 和 G等位基因的頻率分別為63.60%和36.40%；預期基因型TT、GT和 GG 分 別 有92例（40.35%）、106例（46.49%）、30例（13.16%），經χ2檢驗分析，所選隨機人群 GGCX（rs6738645）等位基因頻率和基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡（χ2＝0.592，P＝0.501）。

表1 基因多態性與穩定狀態華法林抗凝的相關性（±s，n＝176）

表1 基因多態性與穩定狀態華法林抗凝的相關性（±s，n＝176）

基因型 n INR PT 華法林（mg／d）TT 62 1.85±0.27 21.26±2.16 3.13±0.87 GT 96 1.88±0.20 21.65±1.70 3.20±0.95 GG 18 1.93±0.27 21.97±2.30 1.85±0.73 F 0.420 0.611 8.805 P 0.658 0.545 0.000

2.3 GGCX（rs6738645）基因多態性對華法林抗凝的影響176瓣膜置換術患者，基因型TT、GT、GG分別為62例，96例，18例，當達到穩定抗凝狀態時，GGCX（rs6738645）基因型3組INR、PT比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；華法林日維持劑量GG型低于TT、GT型，差異有統計學意義（P＜0.01），見表1。

3 討 論

人工機械瓣膜置換術后患者需要終身服用華法林抗凝治療，但華法林治療適應證較窄，個體用藥差異大，容易導致出血、栓塞等嚴重并發癥。近年來，國內外研究表明，基因多態性與華法林劑量有重要相關性［7－10］。GGCX是維生素K循環中的關鍵酶，其作用是將無活性的維生素K依賴性凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的前體羧化后成為有活性的凝血因子，近年的研究表明，GGCX是影響抗凝藥華法林劑量個體差異的遺傳因素之一［11－12］，其中研究較多的是 G3261A（rs12714145）位點多態性與華法林劑量個體差異的相關性，但對于GGCX（rs6738645）位點多態性的研究，國內少有相關報道。

本研究中，采用了Snapshot技術，對中國漢族人群GGCX（rs6738645）基因多態性進行分析。研究結果顯示，228例中國漢族人群GGCX（rs6738645）位點的基因型TT、GT、GG分別為84例（36.84%）、122例（53.51%）、22例（9.65%），T 和 G等位基因的頻率分別為63.60%和36.40%；預期基因型TT、GT和 GG 分別為92例 （40.35%）、106例 （46.49%）、30 例（13.16%），經χ2檢驗分析，所選人群 GGCX（rs6738645）等位基因頻率和基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡（χ2＝0.592，P＝0.501）。其中少數等位基因 G的頻率為36.40%。臺灣人群研究顯示，少數等位基因頻率為39.25%［13］；Wadelius等［14］對歐洲人群研究顯示，少數等位基因頻率為30%，與本研究結果基本一致。本研究對176例瓣膜置換術后華法林抗凝治療的患者進行基因多態性測序，176瓣膜置換術患者，基因型TT、GT、GG分別為62例，96例，18例，當達到穩定抗凝狀態時，GGCX（rs6738645）基因型3組INR、PT比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；華法林日維持劑量比較，GG型低于TT、GT型，差異有統計學意義（P＜0.01）。臺灣人群研究顯示，華法林日維持劑量與基因多態性無顯著相關性（P＝0.914）［13］；對歐洲人群研究顯示，華法林日維持劑量與 GGCX（rs6738645）基因多態性具有顯著相關性（P＜0.05）［6.14－16］，研究結果在不同人群間存在差異，可能與不同人種間基因多態性差異相關。

綜上所述，本文初步得出中國漢族人群GGCX（rs6738645）基因型及等位基因分布頻率，并且證實其基因多態性與華法林劑量有顯著相關性，其基因多態性可能是華法林劑量個體性差異的影響因素，但本研究樣本例數較少，需要進一步明確GGCX（rs6738645）基因多態性與華法林抗凝的相關情況，尚需今后擴大樣本量進行深入研究。

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Research on correlation between GGCX（rs6738645）polymorphism and warfarin stable dose＊

LiuYinqiang，YangBaihui，XiaJianming，ZhangXueyu，ZhangGuimin
（DepartmentofCardiovascularSurgery，FirstAffiliatedHospital，KunmingMedicalUniversity，Kunming，Yunnan650032，China）

ObjectiveTo investigate the gamma glutamine carboxylase（GGCX，rs6738645）genotype distribution in Chinese Han population and the correlation between GGCX（rs6738645）polymorphism and the warfarin stable dose in the patient after valve replacement.MethodsThe genotypes of 228cases were detected by the Snapshot technology in order to explore the genotype and allele frequencies.The correlation between the gene polymorphism in 176cases after valve replacement and the stable dose of warfarin was compared.ResultsIn total of 228research subjects，the number of TT，GT and GG genotype were 84（36.84%），122（53.51%）and 22（9.65%）.The frequencies of T and G allele were 63.60%and 36.40%respectively；in 176patients after the valve replacement，the maintenance stable dose of warfarin was lower in GG group than in the TT and GT groups，the differences between the groups showed statistical significance（P＜0.01）.The PT value and INR value had no statistical difference among 3 genotype groups（P＞0.05）.ConclusionThe GGCX（rs6738645）polymorphism in Chinese Han population may be the influencing factor of warfarin individual dose difference in the patients after valve replacement.

gamma-glutamyl carboxylation；gene polymorphism；warfarin；heart valve prosthesis implantation

10.3969／j.issn.1671-8348.2014.10.010

A

1671-8348（2014）10-1184-03

云南省創新團隊計劃資助項目（2011CI137）。

劉寅強（1980－），主治醫師，在讀博士研究生，主要從事心血管外科疾病分子生物學研究。

2013-09-20

2013-12-24）

論著·臨床研究