脂肪源性干細(xì)胞無(wú)酶分離培養(yǎng)方法的研究＊

劉 蘋，史春夢(mèng)△，胡玲莉，張 波，王正國(guó)（1.第三軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院復(fù)合傷研究所／創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 40008；.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所四室，重慶 40004；.湖北省孝感市9589部隊(duì)后勤部門診部，湖北孝感 4000）

脂肪源性干細(xì)胞無(wú)酶分離培養(yǎng)方法的研究＊

劉 蘋1，2，史春夢(mèng)1，2△，胡玲莉3，張 波2，王正國(guó)2（1.第三軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院復(fù)合傷研究所／創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400038；2.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所四室，重慶 400042；3.湖北省孝感市95829部隊(duì)后勤部門診部，湖北孝感 432000）

目的探索適合臨床治療應(yīng)用的脂肪源性干細(xì)胞（ADSCs）分離培養(yǎng)方法。方法分別采用無(wú)酶分離法和膠原酶消化法從脂肪抽吸術(shù)抽吸的人脂肪組織中分離培養(yǎng)細(xì)胞，對(duì)比分析分離的間充質(zhì)干細(xì)胞特性。結(jié)果無(wú)酶分離法所需時(shí)間僅為膠原酶消化法的1／3，分離的細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)學(xué)、增殖能力、免疫表型、分化潛能等特性與膠原酶消化法分離培養(yǎng)的細(xì)胞一致。結(jié)論無(wú)酶分離法能夠從脂肪抽吸術(shù)抽吸的人脂肪組織中分離培養(yǎng)出ADSCs，是一種安全可靠、適合臨床應(yīng)用的ADSCs分離培養(yǎng)方法。

脂肪源性干細(xì)胞；分離方法；無(wú)酶；膠原酶消化法；細(xì)胞，培養(yǎng)的；脂肪組織

王正國(guó)

脂肪源性干細(xì)胞（adipose derived stem cells，ADSCs）是一種存在于脂肪組織中的間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs），在皮下白色脂肪組織中占細(xì)胞總量的10%～20%。自Zuk等［1］從人抽吸的脂肪組織中成功分離出ADSCs以來(lái)，采用膠原酶、分散酶、胰蛋白酶、透明質(zhì)酸酶等酶類消化，已經(jīng)建立了多種ADSCs的分離培養(yǎng)方法，但不同實(shí)驗(yàn)室采用不同的分離培養(yǎng)方法獲得的干細(xì)胞數(shù)量、免疫表型、功能等存在一定的差異［2］，難以有效地多中心對(duì)照研究ADSCs的治療潛能；分離用的酶類價(jià)格昂貴，且多來(lái)源于動(dòng)物或細(xì)菌，易對(duì)臨床應(yīng)用造成病毒污染或免疫反應(yīng)；而且這些分離方法耗費(fèi)時(shí)間［3－4］。故建立高效、穩(wěn)定可靠的、適合臨床應(yīng)用的ADSCs分離培養(yǎng)方法，將推動(dòng)ADSCs的深入研究和臨床治療的廣泛應(yīng)用［5－7］。因此，本研究在以往分離培養(yǎng)ADSCs方法的基礎(chǔ)上，探索無(wú)酶分離方法從脂肪抽吸術(shù)抽吸的人脂肪組織中分離培養(yǎng)ADSCs，并鑒定分析分離培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)、增殖能力、免疫表型、分化潛能等方面指標(biāo)，為下一步研究與臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 人脂肪組織來(lái)源于臨床進(jìn)行脂肪抽吸術(shù)的患者腹部皮下組織，共14例，其中男3例，女11例，年齡（44.0±11.6）歲，均簽署知情同意書。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 ADSCs的分離培養(yǎng)方法 （1）將收集的人脂肪組織100～300mL置于500mL的玻璃瓶，加入50mL磷酸鹽緩沖液（PBS），擰緊瓶蓋，用手劇烈震蕩2～4min；室溫靜置約5min使液體與脂肪組織分離，收集瓶底的液體至50mL于離心管內(nèi)；將漂浮的脂肪組織重復(fù)以上步驟漂洗2～4次，收集下層的液體，1 200r／min室溫離心10min，收集沉淀。（2）加入2 mL氯化銨紅細(xì)胞裂解液于沉淀組織中，輕輕吹打混勻，裂解1～2min，加入15～20mL PBS混勻，2 000r／min離心5min，棄紅色上清液。（3）細(xì)胞沉淀用PBS洗滌2次，按5.0×104個(gè)／cm2的密度接種于50mL培養(yǎng)瓶中，加入含10% 胎牛血清（FBS）的DMEM／F12培養(yǎng)基，置于37℃、飽和濕度的5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。（4）培養(yǎng)24h后全量換液，棄未貼壁細(xì)胞，以后根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每3天換液1次，待細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)用0.025%胰酶／乙二胺四乙酸消化傳代，隔天換液；倒置相差顯微鏡觀察記錄培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)情況。同時(shí)利用0.1%膠原酶消化法分離培養(yǎng)ADSCs作為對(duì)照，按照以往研究的ADSCs分離方法進(jìn)行操作。

1.2.2 ADSCs生物學(xué)特性檢測(cè) （1）增殖能力：將第3代ADSCs，以細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間：Td＝t×［lg2／（lgNt－lgN0）］，其中 Td代表細(xì)胞倍增時(shí)間，t代表培養(yǎng)時(shí)間，N0、Nt分別代表接種后及培養(yǎng)t小時(shí)后的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值得到細(xì)胞倍增時(shí)間。（2）免疫表型特征：取第4代脂肪組織分離細(xì)胞，利用流式細(xì)胞分析儀（FCM）檢測(cè)細(xì)胞CD90、CD73、CD14、CD105、CD45等的表達(dá)。（3）分離細(xì)胞胚層來(lái)源：將分離培養(yǎng)的細(xì)胞用α－平滑肌動(dòng)蛋白（α-SMA）抗體和波形蛋白（VIM）抗體進(jìn)行免疫熒光染色，采用共聚焦激光掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM）觀察。

1.2.3 ADSCs的多向分化潛能鑒定

1.2.3.1 向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化 （1）以5.00×104個(gè)／mL密度將第3代ADSCs接種于預(yù)先置有蓋玻片的6孔板內(nèi)以制備細(xì)胞爬片。（2）細(xì)胞達(dá)到80%融合后，加入成脂條件培養(yǎng)基（含1μmol／L地塞米松、10mg／L胰島素、0.50mmol／L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基）2mL，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（3）隔天換液1次，共誘導(dǎo)28d，對(duì)照組加入含10%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。（4）誘導(dǎo)28d后應(yīng)用油紅O染色法檢測(cè)脂滴形成。

1.2.3.2 向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化 （1）方法同1.2.3.1中的（1）。（2）細(xì)胞達(dá)到80%融合后，加入成骨條件培養(yǎng)基（含1 μmol／L地塞米松、50μg／mL 維生素 C、10mmol／Lβ－甘油磷酸鈉的高糖DMEM培養(yǎng)基）2mL，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（3）方法同1.2.3.1中的（3）。（4）誘導(dǎo)28d后應(yīng)用茜素紅染色法檢測(cè)鈣沉積。

1.2.3.3 向成軟骨誘導(dǎo)分化 （1）將消化下來(lái)的ADSCs用非完全成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基2 000r／min離心5min，漂洗1次，吸棄上清液。（2）用非完全成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基按照7.50×105個(gè)／mL重懸，用2 000r／min離心5min，漂洗1次，吸棄上清液。（3）將轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor，TGF）-β3解凍，加至非完全成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，成為完全成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（每次使用前現(xiàn)配）。（4）將細(xì)胞按照5×105個(gè)／mL用完全成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基重懸，按照每份0.50mL（2.50×105）分裝至誘導(dǎo)培養(yǎng)用的離心管內(nèi)，用2 000r／min離心5min，共做6份。（5）擰松蓋子，置細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)；每2～3天用0.50mL完全成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基換液（避免將細(xì)胞吹起）。（6）共誘導(dǎo)14～21d后，用甲醛固定，切片，阿辛藍(lán)染色。

1.2.3.4 油紅O染色 （1）取成脂誘導(dǎo)28d的細(xì)胞爬片，用PBS清洗2次，每次5min。（2）用4%多聚甲醛固定15min，PBS漂洗2次，每次5min。（3）用60%異丙醇漂洗爬片1次。（4）將油紅O染液配制成2%濃度，使用前用濾紙過(guò)濾后，滴至細(xì)胞爬片上染色15min。（5）吸棄染料，蒸餾水沖洗，鏡下觀察脂肪細(xì)胞形態(tài)及染色情況。

1.2.3.5 茜素紅染色 （1）取成骨誘導(dǎo)28d的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定15min。（2）蒸餾水沖洗3次，加入0.1%茜素紅Tris-HCl染液（pH 8.3），37℃下染色3～5min。（3）蒸餾水沖洗，干燥，鏡下觀察成骨細(xì)胞形態(tài)及染色情況。

1.2.3.6 阿辛藍(lán)染色 （1）將固定的成軟骨誘導(dǎo)的細(xì)胞球形體切片脫蠟至水。（2）根據(jù)需要應(yīng)用不同pH的阿辛藍(lán)染色浸染切片10～60min。（3）流水沖洗5min左右。（4）脫水，透明并封片，顯微鏡下觀察。

1.2.4 細(xì)胞免疫熒光染色 （1）取細(xì)胞爬片，PBS漂洗2次，用無(wú)水甲醇－10℃固定10min。（2）用PBS充分漂洗3次，加含0.1%Triton-X 100的PBS破膜20min。（3）用PBS充分漂洗3次，加入含10%二抗血清的封閉液封閉30min。（4）滴加稀釋適度的一抗（α-SMA抗體1∶400，VIM抗體1∶200稀釋），4℃冰箱孵育過(guò)夜。（5）用PBS充分漂洗5次，滴加熒光標(biāo)記的二抗，在濕盒內(nèi)37℃避光孵育45min。（6）用PBS充分漂洗5次，滴加4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色5～10min。（7）滴加甘油封片劑封片，采用CLSM觀察。

2 結(jié) 果

2.1 ADSCs的細(xì)胞形態(tài)與增殖 利用無(wú)酶分離法可從脂肪組織分離出1.10×104～8.50×104個(gè)／mL的活性細(xì)胞，需要耗費(fèi)時(shí)間50min左右，而膠原酶消化分離法至少需要150min以上。在DMEM／F12培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)3d左右可增殖形成集落樣，第6天細(xì)胞能生長(zhǎng)至80%～90%的融合，大部分細(xì)胞形態(tài)為梭形或三角形的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞（圖1A），有少量組織碎片；傳代第2或3代后細(xì)胞形態(tài)更單一呈梭形、旋渦狀生長(zhǎng)，增殖迅速，細(xì)胞3～5d可傳代，分離培養(yǎng)的細(xì)胞可傳近8代，而未見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)明顯變化（圖1B、C），傳至10代以上的ADSCs的細(xì)胞質(zhì)變得扁平，增殖速度稍有下降（圖1D），但也有部分細(xì)胞能夠傳10代后仍可保持穩(wěn)定的形態(tài)和增殖速度。與膠原酶分離培養(yǎng)的ADSCs未見(jiàn)明顯差異。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示，無(wú)酶法培養(yǎng)條件下第3代的ADSCs有較強(qiáng)的增殖能力，第4、5天細(xì)胞能夠長(zhǎng)滿培養(yǎng)板底部，7d內(nèi)至少可增殖近8倍，生長(zhǎng)曲線有明顯的增殖期和平臺(tái)期，計(jì)算第3代ADSCs的細(xì)胞倍增時(shí)間為（61.30±7.30）h，與膠原酶法分離的細(xì)胞相似。α-SMA和VIM的表達(dá)是中胚層來(lái)源組織細(xì)胞的重要標(biāo)志。培養(yǎng)至第3代的ADSCs免疫熒光染色顯示，絕大部分細(xì)胞均表達(dá)α-SMA和VIM（圖2），表明從脂肪組織分離獲得的細(xì)胞來(lái)源于中胚層。

2.2 ADSCs的免疫表型特征 無(wú)酶法分離細(xì)胞的FCM分析結(jié)果可見(jiàn)，傳至第4代的ADSCs的干細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志CD90、CD73、CD105均為陽(yáng)性，陽(yáng)性率均在98.00%以上，而造血細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志CD45和CD14為陰性；CD105＋CD45－的細(xì)胞在95.00%以上，CD73＋CD14－的細(xì)胞達(dá)98.30%，見(jiàn)圖3。表明分離培養(yǎng)獲得的細(xì)胞是來(lái)源于間質(zhì)的純度較高的干細(xì)胞，并排除造血細(xì)胞的污染。

2.3 ADSCs的多向分化潛能 無(wú)酶分離法分離細(xì)胞經(jīng)過(guò)28 d的成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)后，倒置相差顯微鏡下可見(jiàn)大部分細(xì)胞變成圓形、橢圓性或短梭形，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有較多明亮的脂滴；未經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞為長(zhǎng)梭形，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)未見(jiàn)脂滴，油紅O染色可見(jiàn)成脂誘導(dǎo)后的細(xì)胞內(nèi)有較多橙紅色的脂滴（圖4A），而未誘導(dǎo)的ADSCs的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)未見(jiàn)脂滴出現(xiàn)。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后，倒置相差顯微鏡下可見(jiàn)大部分細(xì)胞變成多角形或短梭形，可見(jiàn)沙樣顆粒沉積，對(duì)照組細(xì)胞無(wú)特殊變化，茜素紅染色可見(jiàn)成骨誘導(dǎo)后的細(xì)胞有較多紅色礦化基質(zhì)沉積（圖4B），而未誘導(dǎo)的ADSCs未見(jiàn)紅色沉積物。進(jìn)行成軟骨誘導(dǎo)的ADSCs第2天可肉眼發(fā)現(xiàn)錐形管底部形成白色顆粒，顯微鏡下為細(xì)胞聚集的球形體。在21d的誘導(dǎo)過(guò)程中，ADSCs的細(xì)胞球形體體積未見(jiàn)明顯變化；將21d成軟骨誘導(dǎo)分化的細(xì)胞進(jìn)行阿辛藍(lán)染色，可見(jiàn)大多數(shù)細(xì)胞均顯示藍(lán)色（圖4C），提示誘導(dǎo)后細(xì)胞表達(dá)軟骨細(xì)胞特異性的Ⅱ型膠原蛋白。

圖1 倒置相差顯微鏡下觀察分離培養(yǎng)的ADSCs細(xì)胞形態(tài)（×40）

圖3 第3代ADSCs免疫表型的FCM分析鑒定圖

圖4 培養(yǎng)ADSCs的多向分化潛能鑒定（×40）

3 討 論

MSCs是中胚層來(lái)源的一類具有多向分化能力的干細(xì)胞，目前，MSCs并無(wú)特異性的表面標(biāo)志物，其鑒定主要是根據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、生長(zhǎng)特征、多種免疫表型及多向分化潛能來(lái)綜合判斷［8］。細(xì)胞治療國(guó)際協(xié)會(huì)認(rèn)為評(píng)判分離的細(xì)胞是否為 MSCs的最低標(biāo)準(zhǔn)是［9］：（1）分離的細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)呈成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞；（2）細(xì)胞免疫表型的CD105、CD73、CD90、CD166、CD44等分子表達(dá)必須大于 95%，而CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79或CD19、人白細(xì)胞 DR抗原（HLA-DR）等分子表達(dá)小于2%；（3）多向分化潛能，細(xì)胞在體外特定的誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下必須能夠分化成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等中胚層來(lái)源細(xì)胞。因此，本研究分別從細(xì)胞形態(tài)、增殖能力、免疫表型、胚層來(lái)源、分化潛能等5個(gè)方面鑒定采用無(wú)酶分離法從脂肪組織分離培養(yǎng)的細(xì)胞。

本研究結(jié)果顯示，從人脂肪組織中分離培養(yǎng)的細(xì)胞能夠在培養(yǎng)瓶貼壁生長(zhǎng)，呈較為均一的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，與骨髓來(lái)源MSCs的細(xì)胞形態(tài)相似；細(xì)胞能傳代培養(yǎng)近10代，并保持細(xì)胞形態(tài)與增殖能力無(wú)明顯變化；第3代的ADSCs細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示分離培養(yǎng)的細(xì)胞增殖迅速，計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間為（61.30±7.30）h，與其他人分離培養(yǎng) ADSCs的研究報(bào)道基本一致，與成人骨髓、臍帶血、臍帶組織等來(lái)源MSCs的倍增時(shí)間（60h）無(wú)明顯差異［10－12］。FCM 分析結(jié)果可見(jiàn)分離培養(yǎng)細(xì)胞的干細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物CD73、CD90、CD105等均為高表達(dá)，陽(yáng)性率均超過(guò)95.00%，而造血干細(xì)胞抗原標(biāo)志物CD45和CD14為陰性，提示分離的細(xì)胞群具有間充質(zhì)干細(xì)胞的抗原標(biāo)志而不是造血干細(xì)胞，抗體雙標(biāo)FCM分析顯示CD105＋CD45－和CD73＋CD14－的細(xì)胞占95.00%以上，進(jìn)一步確認(rèn)從脂肪組織分離獲得純度較高的MSCs，與其他組織來(lái)源MSCs的免疫表型一致［13］。α-SMA和VIM的表達(dá)是中胚層來(lái)源組織的重要標(biāo)志。分離培養(yǎng)的細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯示分離培養(yǎng)的絕大部分細(xì)胞表達(dá)α-SMA和VIM，提示從脂肪組織分離培養(yǎng)的ADSCs來(lái)源于中胚層組織。多向分化潛能是MSCs的重要特性［9］，向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞等中胚層來(lái)源細(xì)胞分化是鑒定MSCs的必備條件。本研究結(jié)果顯示，從脂肪組織分離培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化后，大部分細(xì)胞的油紅O染色陽(yáng)性，經(jīng)成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞形成茜素紅染色陽(yáng)性的鈣結(jié)節(jié)，經(jīng)成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的大部分細(xì)胞經(jīng)阿辛藍(lán)染色為陽(yáng)性，提示本研究分離培養(yǎng)的細(xì)胞在特定的誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下具備向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞分化等多向分化潛能。以上結(jié)果表明從脂肪組織分離的基質(zhì)細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)與增殖能力、免疫表型和多向分化潛能上均與廣泛接受的MSCs鑒定標(biāo)準(zhǔn)相符合，故無(wú)酶分離法從脂肪抽吸術(shù)抽吸的人脂肪組織中分離培養(yǎng)的細(xì)胞為ADSCs。

本研究結(jié)果表明采用無(wú)酶分離法從脂肪組織中分離獲得的細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)特性、免疫表型、分化潛能等特性方面與文獻(xiàn)報(bào)道膠原酶消化法分離的ADSCs未見(jiàn)明顯差異［14］。雖然無(wú)酶分離法分離ADSCs的細(xì)胞產(chǎn)量較膠原酶消化法獲得的細(xì)胞產(chǎn)量明顯減少，但耗費(fèi)時(shí)間只有膠原酶消化法的1／3，同時(shí)避免了酶消化對(duì)細(xì)胞的損傷和破壞作用。更重要的是無(wú)酶分離法可排除動(dòng)物或細(xì)菌來(lái)源的異源性酶類對(duì)分離細(xì)胞的臨床應(yīng)用造成病毒污染或免疫反應(yīng)，可望為臨床提供適合治療應(yīng)用的干細(xì)胞。

綜上所述，無(wú)酶分離法是一種能夠從脂肪抽吸術(shù)抽吸的人脂肪組織中分離培養(yǎng)出ADSCs的、穩(wěn)定可靠的、適合臨床應(yīng)用的ADSCs分離培養(yǎng)方法。脂肪抽吸術(shù)是一種可以獲得大量脂肪組織的安全“微創(chuàng)技術(shù)”，通過(guò)美容及整形外科去除人體多余脂肪的常用手段，可獲得大量的基質(zhì)干細(xì)胞，使ADSCs有望替代骨髓MSCs，而成為細(xì)胞治療多種疾病的干細(xì)胞來(lái)源［15］。

院士簡(jiǎn)介：王正國(guó)，中國(guó)工程院首批院士，美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院教授會(huì)成員。我國(guó)野戰(zhàn)外科學(xué)、沖擊傷、創(chuàng)傷彈道學(xué)、交通醫(yī)學(xué)研究的主要?jiǎng)?chuàng)始人，在國(guó)際上享有較高聲譽(yù)。1999作為首席科學(xué)家主持我國(guó)創(chuàng)傷醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域和全軍第一個(gè)“973”項(xiàng)目。2005年在北京香山會(huì)議“再生醫(yī)學(xué)”主題研討會(huì)上首次提出了研究通用型干細(xì)胞的設(shè)想和目標(biāo)。先后獲得以國(guó)家科技進(jìn)步一等獎(jiǎng)為代表的各類獎(jiǎng)項(xiàng)20余項(xiàng)。1996年獲軍隊(duì)專業(yè)技術(shù)重大貢獻(xiàn)獎(jiǎng)，1997年獲“何梁何利”獎(jiǎng)，1998年獲美國(guó)“Michael DeBakey國(guó)際軍醫(yī)獎(jiǎng)”（該獎(jiǎng)設(shè)立以來(lái)獲此殊榮的惟一亞洲人），獲重慶市首屆爭(zhēng)光貢獻(xiàn)獎(jiǎng)，2000年獲陳嘉庚獎(jiǎng)和國(guó)際交通醫(yī)學(xué)重大貢獻(xiàn)獎(jiǎng)，2002年獲第四屆中國(guó)光華工程科技獎(jiǎng)，2009年獲吳階平獎(jiǎng)。

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Study on non-enzymatic separation and culture method of adipose-derived stem cells＊

LiuPing1，2，ShiChunmeng1，2△，HuLingli3，ZhangBo2，WangZhengguo2
（1.ResearchInstituteofCombinedInjuries，CollegeofPreventiveMedicine，ThirdMilitaryMedicalUniversity，StateKeyLabofTrauma，BurnsandCombinedInjury，Chongqing400038，China；2.FourthRoom，ResearchInstituteofFieldSurgery，ThirdMilitaryMedicalUniversity，Chongqing400042，China；3.OutpatientDepartmentofLogistics，Unit95829，Xiaogan，Hubei432000，China）

ObjectiveTo explore a separation and culture method of human adipose-derived stem cells（ADSCs）suitable for the clinical application.MethodsThe non-enzymatic method and the collagenase digestion method were adopted to isolate and culture the cells from the human adipose tissue in the individuals with liposuction.The characteristics of isolated mesenchymal stem cells were comparatively analyzed.ResultsThe required time in the non-enzymatic method was one third of that in the collagenase digestion method and the cellular morphology，reproductive capacity，immunophenotype and differentiation potential of the isolated cells were consistent to those isolated by the collagenase digestion method.ConclusionThe no-enzymatic method may isolate and culture ADSCs from the adipose tissue in the individual with liposuction，which is a safety and reliable isolation and culture method of human adipose tissue-derived stem cells suitable for clinical application.

adipose derived stem cells；separation method；no-enzymatic；collagenase digestion method；cells，cultured；adipose tissue

10.3969／j.issn.1671-8348.2014.10.001

A

1671-8348（2014）10-1153-04

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973）專項(xiàng)課題資助項(xiàng)目（2011CB964701）；重慶市科技攻關(guān)（重點(diǎn)）資助項(xiàng)目（cstc2012GGB10003）。

劉蘋（1971－），高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，碩士研究生，主要從事再生醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)研究。△

，Tel：13708396812；E-mail：shicm1010＠aliyun.com。

2013-10-08

2013-12-19）

論著·臨床研究