何首烏飲對衰老大鼠下頜下腺端粒酶活性的影響

葛志華 李俊玫 李俊穎 于海忠 楊 寧 王春艷

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院科研處，河北 承德 067000)

70%唾液和近50種生物活性物質(zhì)由下頜下腺分泌〔1〕，研究發(fā)現(xiàn)老年患者出現(xiàn)口干癥狀可能與衰老導(dǎo)致下頜下腺腺泡和導(dǎo)管細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)改變，外分泌功能明顯降低有關(guān)〔2〕。本研究所用何首烏飲由《宣明論》何首烏丸加味而成(炙何首烏、懷牛膝、肉蓯蓉、淫羊藿、丹參、茯苓),具有補(bǔ)肝腎、益精血、延年益壽之功效。研究發(fā)現(xiàn)，何首烏飲可使衰老大鼠超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活力明顯升高，總抗氧化能力(T-AOC)增強(qiáng)，丙二醛(MDA)顯著降低；可改善衰老大鼠下頜下腺超微結(jié)構(gòu)的衰老變化、抑制細(xì)胞凋亡而達(dá)到延緩細(xì)胞衰老、凋亡的目的〔2～5〕。近年發(fā)現(xiàn)細(xì)胞衰老與細(xì)胞內(nèi)染色體末端端粒長度密切相關(guān)，端粒酶再激活被認(rèn)為是細(xì)胞逃脫衰老的重要機(jī)制。本文觀察何首烏飲對衰老大鼠下頜下腺端粒酶活性的影響。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑 何首烏飲方劑所用中藥購自承德富爾康藥業(yè)有限公司；端粒酶活性檢測TRA-ELISA試劑盒，Roche公司；D-半乳糖，北京化學(xué)試劑公司；細(xì)胞裂解試劑盒，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2實(shí)驗動物的選擇及分組 選用8周齡清潔級SD雌性大鼠20只，體重180～220 g，購自河北省實(shí)驗動物中心。將大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、何首烏飲預(yù)防組、何首烏飲治療組每組5只。

1.3模型的建立及各組動物的處理方法 正常組正常喂養(yǎng)60 d；模型組腹腔注射D-半乳糖300 mg·kg-1·d-1，連續(xù) 60 d；何首烏飲預(yù)防組稱重后腹腔注射D-半乳糖(量同模型組)同時灌胃何首烏飲1.936 g·100 g-1·d-1，水煎濃縮成0.6 ml·100 g-1·d-1，1次/d，連續(xù)60 d。何首烏飲治療組大鼠稱重后腹腔注射D-半乳糖(量同模型組)60 d后，灌胃何首烏飲1.936 g·100 g-1·d-1，水煎濃縮成0.6 ml·100 g-1·d-1，1次/d，連續(xù)60 d。各組大鼠末次給藥后1 h，用10%水合氯醛(0.3 ml/100 mg)腹腔注射麻醉，分離并摘取下頜下腺，置液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4采用端粒重復(fù)擴(kuò)增-微孔板雜交法檢測下頜下腺細(xì)胞端粒酶活性 取100 mg(-70℃ )冷凍下頜下腺組織，經(jīng)洗液漂洗、離心沉淀后加200 μl冷裂解液，自動勻漿器冰浴中勻漿，離心、移取上清液，-70℃保存。端粒序列的復(fù)制及TRAP擴(kuò)增：每管加入約5 μl的細(xì)胞裂解液，25 μl混合物，5 μl內(nèi)標(biāo)引物,用無DNAase的雙蒸水補(bǔ)至50 μl；25℃ 反應(yīng)30 min，合成端粒酶延伸產(chǎn)物。然后加熱滅活端粒酶，加入0.1 μg CX和2 μl Taq酶進(jìn)行PCR反應(yīng)。產(chǎn)物的固相與雜交(包被、變性、雜交與顯色)取樣品和內(nèi)參對照PCR產(chǎn)物各2.5 μl于96孔板上，同時設(shè)空白裂解液和樣品滅活的對照，每孔加入10 μl變性液，樣品一分為二，分別加入100 μl雜交液T或100 μl雜交液IS，混合后，加入預(yù)處理過的96孔板中，封口，37℃ 300 r/min 2 h；吸去雜交液，用洗滌液洗3次，加入Anti-DIG-HRP工作液，300 r/min，室溫30 min；去雜交液。洗5次，加入TMB底物溶液，300 r/min室溫20 min；最后加入終止液，在30 min內(nèi)于450 nm處測吸光度值，按公式計算端粒酶的相對活性。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11.0軟件行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

正常組、模型組、何首烏飲預(yù)防組、何首烏飲治療組間端粒酶活性O(shè)D值(0.28±0.51，0.03±0.06，0.26±0.21，0.11±0.01)表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。多重比較結(jié)果顯示，模型組端粒酶OD值最低，正常組最高，何首烏飲預(yù)防組低于正常組，但高于其他各組(P<0.01)。

3 討 論

唾液具有消化功能和潤滑、防御、保護(hù)、抗菌及內(nèi)分泌作用。隨著年齡增長，下頜下腺會出現(xiàn)增齡性變化，唾液流量及成分亦將產(chǎn)生明顯的變化，致使唾液量減少而黏稠，導(dǎo)致口干，進(jìn)而影響咀嚼和吞咽；防御、保護(hù)和抗菌作用減退可成為涎腺炎、蛀牙、牙周疾病和持續(xù)的口腔感染的影響因素〔6〕；衰老還可影響下頜下腺分泌生物活性物質(zhì)〔如神經(jīng)生長因子(NGF)、表皮生長因子(EGF)等〕的功能，繼而引起其他一系列繼發(fā)性變化。因此，下頜下腺的抗衰老研究對衰老病人的涎腺功能減退性疾病的預(yù)防、治療具有重要意義。

近年發(fā)現(xiàn)細(xì)胞衰老與細(xì)胞內(nèi)染色體末端端粒長度密切相關(guān)，端粒存在于真核生物線形染色體末端，由串聯(lián)重復(fù)的短 DNA序列及其相關(guān)蛋白組成 DNA蛋白復(fù)合體。主要作用為防止染色體 DNA 降解、 末端融合缺失和非正常重組。端粒酶具有促進(jìn)端粒延伸的作用，在沒有端粒酶的細(xì)胞中，端粒會逐漸縮短直至染色體損傷；有端粒酶存在的細(xì)胞，則端粒的長度能得以保持，使之處于一種不斷伸縮的動態(tài)平衡中〔7〕。在端粒酶處于抑制狀態(tài)的細(xì)胞分裂時，DNA 不完全復(fù)制會引起端粒DNA的少量丟失，隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增加，端粒不斷縮短。當(dāng)端?？s短到一定程度(臨界長度)時引發(fā) Hayflick 極限，細(xì)胞不再分裂增殖而衰老死亡〔8〕。因此，端粒酶再激活被認(rèn)為是細(xì)胞逃脫衰老的重要機(jī)制。

結(jié)果提示，組織端粒酶活性的下降是導(dǎo)致衰老的原因之一，而何首烏飲可提高衰老大鼠下頜下腺端粒酶活性，延緩端粒縮短。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為脾腎兩虛夾瘀是衰老的基本病機(jī),作用于衰老的全部過程，脾腎兩虛是衰老的本質(zhì)，而瘀血的病理產(chǎn)物則是衰老在脾腎兩虛的前提下的必然結(jié)果。何首烏飲具有烏發(fā)，填精補(bǔ)髓功效。在此基礎(chǔ)上加淫羊藿補(bǔ)腎陽，強(qiáng)筋骨，丹參活血化瘀、養(yǎng)心安神，茯苓健脾化濕，以達(dá)到補(bǔ)肝腎、益精血、延年益壽之功效。已有研究顯示〔9，10〕何首烏飲方劑能延緩衰老大鼠卵巢細(xì)胞及腎臟細(xì)胞凋亡的發(fā)生。而本研究結(jié)果顯示何首烏飲延緩衰老的機(jī)制可能與其增加組織的端粒酶活性有關(guān)。

4 參考文獻(xiàn)

1何江才，姚國剛，賈雪梅.下頜下腺內(nèi)生物活性物質(zhì)的研究進(jìn)展〔J〕.四川解剖學(xué)雜志，2000；8(4):217-21.

2葛志華，趙淑敏，楊桂梅，等.何首烏飲對 D-半乳糖所致衰老大鼠下頜下腺超微結(jié)構(gòu)的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2009； 29(14):1778-80.

3葛志華，孫立新，楊桂梅，等.何首烏飲對實(shí)驗性衰老大鼠下頜下腺 T-AOC、MDA的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2011；31(1):105-6.

4葛志華，許 倩，王春艷.何首烏飲對衰老大鼠下頜下腺GSH-PX、MDA的影響〔J〕.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2011；38(51):850-6.

5李俊玫，高福祿，葛志華，等.何首烏飲對衰老大鼠下頜下腺凋亡的影響〔J〕.山東醫(yī)藥，2009； 49(48):34-5.

6Napenas JJ，Brennan MT，F(xiàn)ox PC.Diagnosis and treatment of xerostomia (dry mouth)〔J〕.Odontology,2009;97(2):76-83.

7張 婷，王曉民.端粒、端粒酶的發(fā)現(xiàn)和意義〔J〕.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2009；30(5):718-22.

8馬 宏，張宗玉，童坦君.衰老的生物學(xué)標(biāo)志〔J〕.生理科學(xué)進(jìn)展，2002；33(1):65-8.

9陳 雪，牛嗣云，曲銀娥，等.何首烏飲對衰老大鼠腎臟增殖與凋亡的影響 〔J〕.時珍國醫(yī)國藥，2009；20(3)：650-1.

10李亞麗，周利霞，張 娜，等.何首烏飲對亞急性衰老大鼠卵巢細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因表達(dá)的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2009；29(3):265-7.