樹(shù)鼩在肝臟疾病動(dòng)物模型應(yīng)用的研究進(jìn)展

邢會(huì)杰，方梅霞，宋琳亮，和 君，李守軍，傅江南

(1.暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心，廣州 510632;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642)

生物學(xué)研究中動(dòng)物模型的使用仍將持續(xù)很長(zhǎng)一段時(shí)間。由于倫理及其他如可控性、方便操作及成本效益等方面問(wèn)題，許多基于人類疾病機(jī)理研究和藥物研發(fā)的實(shí)驗(yàn)只能依賴于動(dòng)物模型的建立和使用［1］。考慮到非人靈長(zhǎng)類實(shí)際使用的限制，生物學(xué)研究中尋找非人靈長(zhǎng)類的替代動(dòng)物顯得尤為必要及緊迫。樹(shù)鼩(Tupaia belangeri，tree shrew)是一種生活在熱帶和亞熱帶地區(qū)的哺乳綱攀鼩類的小型動(dòng)物，盡管樹(shù)鼩精確的系統(tǒng)發(fā)育地位仍存在爭(zhēng)論，但是一致認(rèn)為其與靈長(zhǎng)類密切關(guān)聯(lián)［2］，與人類有較近的親緣關(guān)系。最近，昆明動(dòng)物研究所通過(guò)對(duì)樹(shù)鼩全基因組測(cè)定和解析，發(fā)現(xiàn)樹(shù)鼩在神經(jīng)及免疫系統(tǒng)等方面與人類相比具有高度同源性，在很多方面具有可用來(lái)替代獼猴等大型靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳基礎(chǔ)，可能還適合于更多的免疫學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)及代謝等生物學(xué)問(wèn)題和疾病機(jī)理的研究［3］。已有證據(jù)表明樹(shù)鼩非常適合用于人體的近視、心理應(yīng)激和肝炎等問(wèn)題的研究，且對(duì)多種人類易感病毒敏感［4］，本文對(duì)近年來(lái)利用樹(shù)鼩在肝臟疾病動(dòng)物模型中的應(yīng)用進(jìn)展綜述如下。

1 乙型肝炎病毒模型

乙型肝炎病毒 (hepatitis B virus，HBV)感染是全球和我國(guó)的重要健康問(wèn)題，建立方便有效的HBV感染動(dòng)物體內(nèi)模型是開(kāi)展HBV相關(guān)基礎(chǔ)和臨床研究的重要前提，缺乏合適的體內(nèi)外感染HBV實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪亲璧KHBV基礎(chǔ)和臨床研究發(fā)展的主要瓶頸。因此，建立方便有效的、與人類有較近親緣關(guān)系的動(dòng)物感染人HBV模型，是研究HBV的生物學(xué)特性、感染致病機(jī)理及有效防治措施所亟需的重要課題［5］。周勇等［6］將 HBV1.2 質(zhì)粒通過(guò)大隱靜脈用水動(dòng)力注射方法轉(zhuǎn)入樹(shù)鼩肝臟，檢測(cè)樹(shù)鼩血清中ALT、HBV DNA，HBsAg、HBsAb，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染HBV1.2質(zhì)粒后樹(shù)鼩血清中能檢測(cè)到相關(guān)陽(yáng)性指標(biāo)，表明大隱靜脈水動(dòng)力注射法能夠作為樹(shù)鼩肝臟外源基因?qū)氲囊环N方法，這為樹(shù)鼩成為慢性HBV感染模型打下了一定基礎(chǔ)。有人對(duì)56只新生樹(shù)鼩接種來(lái)自HBV感染病人或樹(shù)鼩的血清后分階段收集血清和肝臟樣品，利用 qPCR、酶聯(lián)免疫分析、Southern blot和免疫組化等檢測(cè)分析方法，在接種48周后有6只樹(shù)鼩被確定和4只疑似表現(xiàn)出慢性HBV感染，結(jié)果表明樹(shù)鼩幼仔與人類相比具有一定的可被HBV慢性感染的頻率，從而初步建立了樹(shù)鼩HBV慢性感染模型［7］。同時(shí)，作者對(duì)持續(xù)感染6年HBV的樹(shù)鼩通過(guò)DNA分析、肝臟超微結(jié)構(gòu)電鏡檢測(cè)等方法發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞水腫，脂肪和嗜酸性變性，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和門管區(qū)小膽管增生，多區(qū)域肝壞死融合形成纖維化和硬化的連接和巨紅細(xì)胞癥，其感染HBV病毒的肝臟病理學(xué)變化與人相似［8］。以上研究表明，樹(shù)鼩具有作為 HBV感染新模型的應(yīng)用前景。

2 丙型肝炎病毒模型

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)呈世界流行性，大約3%的世界人口遭受慢性HCV困擾，到目前為止，還沒(méi)有預(yù)防或治療HCV的疫苗面世，因缺乏合適的動(dòng)物模型是導(dǎo)致對(duì)HCV免疫和病源機(jī)制研究和研制更有效治療藥物的主要阻礙因素之一。除了人類之外，黑猩猩是對(duì)HCV易感的唯一物種［9］。由于HCV缺乏理想的動(dòng)物模型，近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)樹(shù)鼩是否可成為HCV感染的動(dòng)物模型作過(guò)一些十分有益的嘗試。Zhao等［10］闡明HCV可在樹(shù)鼩原代肝細(xì)胞進(jìn)行有效的復(fù)制和病毒合成，他們利用HCV病人血清或血漿感染樹(shù)鼩原代肝細(xì)胞，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)到負(fù)性單鏈RNA和病毒顆粒證實(shí)病毒在樹(shù)鼩原代肝細(xì)胞可進(jìn)行有效的感染和復(fù)制。Amako等［11］等用HCV患者血清和HCV全長(zhǎng)cDNA重組的病毒顆粒感染樹(shù)鼩建立HCV樹(shù)鼩模型，并經(jīng)過(guò)長(zhǎng)達(dá)3年觀察，通過(guò)各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)進(jìn)行HCV感染樹(shù)鼩后的病原學(xué)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)急性感染階段出現(xiàn)中度肝炎和斷斷續(xù)續(xù)的病毒血癥，并可導(dǎo)致脂肪變性，肝硬化，結(jié)節(jié)和腫瘤。且通過(guò)組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)HCV引起的慢性肝炎和進(jìn)一步惡化之間存在時(shí)間依賴性。為進(jìn)一步評(píng)價(jià)樹(shù)鼩HCV是否是由傳染的病毒質(zhì)粒引起的，用被感染HCV的樹(shù)鼩血清去感染幼齡樹(shù)鼩，然后通過(guò)對(duì)HCV RNA進(jìn)行檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)受者樹(shù)鼩也表現(xiàn)出中度肝炎和斷斷續(xù)續(xù)的病毒血癥，同時(shí)將具有較高豐度的HCV感染樹(shù)鼩的血清接種幼年樹(shù)鼩后呈現(xiàn)急性感染，表明樹(shù)鼩可有效感染和轉(zhuǎn)染HCV，但是樹(shù)鼩模型和人類感染HCV后的不同之處在于樹(shù)鼩較難保持HCV病人所表現(xiàn)的持續(xù)病毒血癥現(xiàn)象［12］。這些結(jié)果表明樹(shù)鼩有望成為HCV感染和疾病研究的有效動(dòng)物模型進(jìn)行HCV病因及發(fā)病機(jī)制等方面的深入研究。

3 其它病毒肝炎模型

可用于甲型肝炎病毒(hepatitis A virus，HAV)研究的動(dòng)物模型較少，1981年詹美云等人對(duì)HAV感染樹(shù)鼠句進(jìn)行了初步的研究，他們用0.5%HAV陽(yáng)性病人新鮮大便濾液0.5 mL感染9只成年樹(shù)鼠句。通過(guò)檢測(cè)抗原、抗體、轉(zhuǎn)氨酶及肝組織病理檢查等指標(biāo)，在感染2～16周后，78%的樹(shù)血清中檢測(cè)出了HAV抗體，轉(zhuǎn)陽(yáng)率75%。這些證據(jù)說(shuō)明樹(shù)鼠句有可能成為人類甲肝病毒敏感的動(dòng)物。有人認(rèn)為丁型肝炎病毒(hepatitis D virus，HDV)的復(fù)制必需依靠HBV的輔助，因此HDV感染模型必須以HBV感染為基礎(chǔ)［13］。有人以樹(shù)鼩為對(duì)象研究證實(shí)在感染HBV的基礎(chǔ)上，可通過(guò)同時(shí)和重疊感染的方式感染HDV。肝組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，樹(shù)鼩感染HDV后，引起的HDV的肝臟病理變化與人類的極其相似，可呈現(xiàn)不同的病理類型，易形成慢性發(fā)病過(guò)程，從而建立HDV/HBV實(shí)驗(yàn)感染樹(shù)鼩動(dòng)物模型［14］。Yan等［15］認(rèn)為樹(shù)鼩通過(guò)轉(zhuǎn)染HBV/HDV病毒全基因組可以在樹(shù)鼩肝臟細(xì)胞檢測(cè)到病毒復(fù)制，并指出鈉離子/牛磺膽酸共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抗原(sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)在病毒侵入和限制病毒感染方面具有重要作用。以上結(jié)果表明，樹(shù)鼩具有感染甲肝及丁肝的可能，但能否作為此類肝炎病毒的有效模型，尚需進(jìn)一步深入開(kāi)展研究。

4 非酒精性脂肪肝模型

郭小芳等［16］為探討羅格列酮對(duì)脂肪肝細(xì)胞PPA R表達(dá)的影響，通過(guò)對(duì)樹(shù)鼩飼喂高糖高脂飼料建立樹(shù)鼩非酒精性脂肪肝模型，通過(guò)實(shí)驗(yàn)前后檢測(cè)體重(wt)、空腹血糖(FBG)、空腹血清胰島素(FIN S)、總膽固醇(T C)、甘油三醋(T G)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)剖腹取肝標(biāo)本，光鏡下觀察肝臟形態(tài)學(xué)改變，以免疫組化法檢測(cè)肝臟過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPA R)表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖高脂喂養(yǎng)樹(shù)鼩后與空白對(duì)照組相比，其FBG、FINS等均明顯升高，肝臟形態(tài)學(xué)發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重肝脂肪變性。此結(jié)果說(shuō)明高糖高脂飲食可介導(dǎo)樹(shù)鼩引起肝脂肪變性。牛昱宇等［17］使用每公斤樹(shù)鼩普通飼料加20 g膽固醇和200 g豬油為高脂飼料，供樹(shù)鼩自由采食的方法建立樹(shù)鼩非酒精單純性脂肪肝動(dòng)物模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)7周后，60%的樹(shù)鼩呈明顯脂肪肝癥狀，14周后，80%的樹(shù)鼩呈明顯的脂肪肝癥狀，其中20%的樹(shù)鼩呈重癥脂肪肝癥狀，部分樹(shù)鼩有約95%的肝細(xì)胞脂肪化。以上結(jié)果表明樹(shù)鼩可用于非酒精性脂肪肝動(dòng)物模型，尤其是單純性脂肪肝的藥物研究與功效評(píng)價(jià)。

5 肝癌模型

黃曲霉毒素是通過(guò)聚酮途徑由黃曲霉和寄生曲霉所產(chǎn)生的一種對(duì)人類和畜禽危害最大、最常見(jiàn)的霉菌毒素。黃曲霉毒素為肝臟毒素，主要損害肝臟，除了主要誘使動(dòng)物發(fā)生肝癌外，也能誘發(fā)胃癌、腎癌、直腸癌及乳腺、卵巢、小腸等部位的癌癥［18］。Li等［19］利用黃曲霉素對(duì)對(duì)樹(shù)鼩進(jìn)行處理約90周建立樹(shù)鼩肝癌模型用以研究黃曲霉毒素介導(dǎo)的肝細(xì)胞癌形成過(guò)程中的基因調(diào)控作用，通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)處理組樹(shù)鼩肝臟標(biāo)本進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)樹(shù)鼩肝臟發(fā)生癌細(xì)胞變。Yan等［20］在建立了樹(shù)鼩實(shí)驗(yàn)感染人HBV模型的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了黃曲霉毒素與人HBV雙因素在肝細(xì)胞癌形成中作用的研究，結(jié)果首次在動(dòng)物體內(nèi)證實(shí)黃曲霉毒素和HBV在肝細(xì)胞癌形成過(guò)程中有協(xié)同作用。Su等［21］利用HBV和黃曲霉素對(duì)樹(shù)鼩處理后，研究p53蛋白和p21蛋白在樹(shù)鼩肝癌形成過(guò)程中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)p53蛋白的變異和肝癌的發(fā)生密切相關(guān)，p21蛋白的過(guò)量表達(dá)在肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到重要的作用。

綜上所述，樹(shù)鼩在人類肝臟疾病模型中的應(yīng)用已經(jīng)進(jìn)行了廣泛的研究，但由于以往研究所用的樹(shù)鼩多為野外捕獲的動(dòng)物，還沒(méi)有實(shí)現(xiàn)樹(shù)鼩標(biāo)準(zhǔn)化，因此，在建立樹(shù)鼩肝臟疾病模型的穩(wěn)定性和重復(fù)性方面存在不足，致使一些學(xué)者提出質(zhì)疑，很大程度上限制了樹(shù)鼩作為肝臟疾病動(dòng)物模型應(yīng)用的研究進(jìn)展。但隨著樹(shù)鼩規(guī)模化繁殖、生物凈化及建立相應(yīng)的微生物質(zhì)量控制品系后，樹(shù)鼩將會(huì)在包括肝臟疾病在內(nèi)的醫(yī)學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮極大的作用，尤其在人類疾病的致病機(jī)理研究和建立人類疾病的樹(shù)鼩模型對(duì)治療藥物的開(kāi)發(fā)及其評(píng)價(jià)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

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