骨髓基質干細胞研究進展

和鳳軍 陳 普 陳學秋 唐柱生

云南中醫學院，云南 昆明 650500

骨髓基質干細胞 (Bone marrow stromal stem cells，BMSCs)屬于中胚層細胞，該細胞為多能干細胞，取材容易，對機體損傷小，易于基因操作，分離培養簡便，擴增能力強，免疫性低等特點。BMSCs在某些信號和特定條件的影響下，可分化為成骨細胞、軟骨細胞、神經細胞、脂肪細胞、心肌細胞等，還可以跨胚層分化，已廣泛應用于腦和脊髓損傷、骨損傷、軟骨缺損與損傷、心肌細胞損傷等的修復、基因治療和臨床治療的研究，具有廣闊的臨床應用前景。現將骨髓基質干細胞 (BMSCs)國內外研究進展綜述如下。

1 骨髓基質干細胞的發現及應用研究現狀

骨髓基質干細胞 (BMSCs)又稱為骨髓間充質干細胞(Bone marrow mesenchymal sterm cells，MSCs)。1976 年Friedenstein等［1］首先提出骨髓間充質干細胞 (MSCs)的概念。骨髓間充質干細胞 (MSCs)因其在培養時呈集落增殖和對塑料培養材料的貼壁特性，曾被稱為集落形成單位成纖維細胞 (colony forming unit fibroblasts，CFUF)或塑料貼壁細胞。骨髓基質干細胞 (BMSCs)存在于骨髓網狀間質內，可分化為骨髓基質細胞 (bone marrow stromal cell，BMSC)等。因該細胞為多能干細胞，分離培養簡便，擴增能力強，免疫性低，同種移植或異種移植時免疫排斥反應弱。BMSCs在某些信號和環境的影響下，錨靠一類組織，分化成該組織細胞。在骨髓中成熟的細胞能夠反分化［2-3］。在特定條件下，還可以跨胚層分化［4-5］。

有研究表明［6-7］，BMSCs體外分離培養后，在一定的信號和環境誘導下，可分化為成骨細胞、軟骨細胞、神經細胞、脂肪細胞、心肌細胞等。在不同的微環境條件下已將BMSCs成功誘導分化為成骨細胞、軟骨細胞、心肌細胞、脂肪細胞、肌肉、皮膚、肝、肺、神經元、神經膠質細胞等，且在人和嚙齒類動物的實驗中均顯示了這種終身分化能力［8-11］。

BMSCs在腦源性神經營養因子 (brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、堿性成纖維生長因子的誘導或與腦組織細胞共同培養下，BMSCs可分化為具有神經元和膠質細胞標志的細胞［12-13］，如微管相關蛋白1B、神經元特異微管 (Tubulin)、神經元特異性烯醇化酶 (NSE)以及波形蛋白。Woodbury［14］等報道，在體外增加細胞內cAMP含量，成年鼠和人的BMSCs可分化為早期神經前體細胞。Tamir A等［23］研究發現，BMSCs約10%處于S+G2+M期，大多數細胞處于G0/G1期，高比例的G0/G1期細胞說明BMSCs具有高度分化的潛能。

目前BMSCs通過蛛網膜下腔注射用于脊髓損傷臨床治療［23，26］，通過局部注射或靜脈注射治療骨關節病［24］，均取得明顯臨床療效，安全性好，副作用輕，初步顯示了廣闊的臨床應用價值。

2 骨髓基質干細胞的制備、培養及生物學特性

2.1 BMSCs的制備、培養 BMSCs主要存在于全身結締組織，以紅骨髓組織中含量最豐富，亦存在于胎兒臍血中［25］。BMSCs的體外培養始于 20世紀 70年代中期，Friedenstein等開始用貼壁的方式培養分離到BMSCs，為紡錘形細胞，經2～4d休眠后迅速增殖，且能多次傳代。

迄今為止，分離BMSCs的方法有:密度梯度離心法、貼壁篩選法、流式細胞儀法、全骨髓培養法、免疫磁珠法等。密度梯度離心法是利用骨髓中各種細胞的密度不同進行分離;全骨髓培養法和貼壁篩選法是利用BMSCs易于貼壁的特性進行純化;流式細胞儀法是根據細胞大小不同和細胞表面的特殊標志進行細胞分選。常用培養基為含體積分數為10%胎牛血清DMEM培養基。

常用的BMSCs分離液有兩種:Percoll分離液 (密度1.073g/mL)和Ficoll分離液 (密度1.077g/mL)。采用密度梯度離心法和貼壁篩選法相結合，利用Percoll分離液可得到高純度的BMSCs［15］。有研究者從臍靜脈的內皮中分離出BMSCs［16］。因BMSCs取材簡便，易于分離培養，組織相容性好，經培養分離純化后可行自體移植、同種移植、異種移植。

2.2 BMSCs的生物學特性 人體骨髓中BMSCs含量很稀少，每1×105～106個單個核細胞中有一個BMSCs，體外分離培養、擴增或純化才能滿足研究和治療的需要。對人和大鼠的熒光激活細胞分類 (fluorescence activated cell Sorter，FACS)分析表明［17-18］，BMSCs含有三個細胞亞群:①大的和明顯成熟細胞 (mature BMSCs);②小的無顆粒細胞;③小的粒細胞 (RS-2 cells)。

傳代培養的BMSCs細胞形態均一，呈梭形、紡錘形。從第6代開始凋亡細胞數量明顯增多，培養至9代后生長緩慢，出現胞漿空泡化，胞體變大等老化現象。第3～6代可用于臨床治療使用［23］。BMSCs表達中等量MHC-I類分子，不表達MHC-Ⅱ類分子與人類白細胞抗原 (HLA)識別有關的T淋巴細胞共刺激分子，BMSCs免疫原性低，機體產生的免疫反應很弱［23］。BMSCs可分泌多種生長因子和細胞因子，如白細胞介素6、白細胞介素11、白細胞介素12等;還可分泌多種神經營養因子，如腦源性神經營養因子、膠質源性神經營養因子、神經生長因子、表皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子等［23］。

目前雖然尚未發現BMSCs的特異性標志物，但研究發現多能間充質干細胞表達特異性標志物如:CD68，CD44，CD77，CD90，而不表達CD34造血干細胞的特異性標志物［19］。向神經細胞轉化的BMSCs不表達造血譜系標志物CD11，CD45， CD34， CD14， 而 表 達 CD44， CD71，CD90［14］。流式細胞技術測定發現，細胞貼壁附著后均一表達 SH2， SH3， CD29， CD44， CD71， CD90， CD106，CD120a，CD124等多種表面蛋白［20］。BMSCs表達多種表面抗原如粘附分子類、整合素家族、生長因子和細胞因子受體家族、干擾素受體和 TNF受體等［25］。BMSCs移植途徑有:靜脈注射、局部注射、硬膜內注射、蛛網膜下腔注射、腹腔注射等。

3 BMSCs向神經細胞分化的研究進展

BMSCs在EGF或BDNF誘導下可分化為神經細胞［21］。Woodbury［14］在體外用 β 巰基乙醇 (BME)及二甲亞砜(DMSO)誘導BMSCs，培養大鼠的神經細胞，80%的細胞表達神經元特異性烯醇化酶 (Neuron specific endolase，NSE)、神經微絲蛋白 (Neurofilament-M，NF-M)及尼氏體。Hou L［22］在體外分離、提純、分化人臍帶血中的BMSCs，而在Mesencult培養基中用熒光激活細胞分選術(FACS)將BMSCs在2、5、8通道誘導分化為神經元細胞。分化的神經元細胞具有特異性標志物NF、NSE及尼氏體，免疫組織化學檢測顯示細胞巢蛋白呈陽性表達。

4 骨髓基質干細胞的應用研究前景和展望

BMSCs因具備多向分化潛能，取材容易，對機體損傷小，易于基因操作，分離培養簡便，擴增能力強，組織相容性好等特點。在某些信號和特定微環境的誘導下，可分化為成骨細胞、軟骨細胞、神經細胞、脂肪細胞、心肌細胞等，還可以跨胚層分化，已廣泛應用于腦和脊髓損傷、骨損傷、軟骨缺損與損傷、心肌細胞損傷等的修復、基因治療、臨床治療的研究，取得了明顯的臨床療效，具有廣闊的臨床應用前景。而BMSCs治療疾病的相關機理探索、BMSCs特異性標志物的發現、BMSCs移植的遠期安全性評價將成為今后的研究重點和研究方向。

［1］Friedenstein AJ，Gorja JF，Kulagina NN.Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs.Exp Hemator，1976，4:267.

［2］Prockop DJ，Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic.Science.1997，276(5309):71-4.

［3］Mezey E，Chandross KJ，Harta G，et al.Turning blood into brain:cells bearing neuronal antigens generated in vivo from bone marrow.Science.2000，290(5497):1779-82.

［4］Bianco P，Gehron Robey P.Marrow stromal stem cells.J Clin Invest.2000，105(12):1663-8.

［5］Pittengen MF，Mackay AM，Beck SC，et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.Science.1999，284(54l):143-147.

［6］Xu W R，Zhang X R，Qian H，et al.Mesenchymal stem cells from adult human bone marrow different time into acardiom yocyte pheuotype in vitro［J］.Exp Biol Med，2004，229:623-631.

［7］Xu W R，Qian H，Zhu W，et al.A norel tumor cellline cloned from mutated human embryonic bone morrow mesenchymal stem cells［J］.Oncology Reports，2004，12(3):501-508.

［8］Kondo M，Wagers AJ，Manz MG，et al.Biology of hematopoietic.Annu Rev Immunol 2003，21;759-806.

［9］Mezey E，Key S，Vogelsang G，et al.Transplanted bone marrow generates new neuron in human brain.Proc Natl Acad Sci USA 2003，100:1364-1369.

［10］Weinann JM，Charlton CA，Brazelton TR，et al.Contribution of transplanted bone marrow cells to Purkinje neurons in human adult brains.Proc Natl Acad Sci USA 2003，100:2088-2093.

［11］Priller J，Persons DA，Klett FF，et al.Neogenesis of cerebellar Purkinje neurons from gene-marked bone marrow cells in vivo.J Cell Biol，2001，155:733-738.

［12］Mezey E，Chandross K J，Harta G，et al.Turning blood into brain:cells bearing neuronal antigens generated in vivo from bone marrow.Science 2000，290:1779.

［13］Sanchez Ramos J，Song S，Cardozo Pelaez F，et al.Adult bone marrow stromal cells differentiate into neural cells in vivo.Exp Neurol，，2000，164:247.

［14］Woodlbury D，Schwarz E J，Prockop D J，et al.Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons.J Neurosci Res 2000;61:364.

［15］李建華，黃連榮，徐永生，等.人骨髓間充質干細胞的生物學特性［J］.現代臨床醫學工程學雜志，2003，9(3):177-179.

［16］Covas D T，Siufi J L，Silva A R.Isolation and culture of umbilical vein mesenchymal stem cells［J］.Braz J Med Biol Res，2003，36(9):1179-1183.

［17］Colter DC，Class R，DiGirolamo CM，et al.Rapid expansion of recycling stem cells in cultures of plastic-adherent cells from human bone marrow.Rroc Natal Acad Sci USA，2000，97:3213.

［18］Javazon EH，Colter DC，Schwarz EJ，et al.Rat marrow stromal cells are more sensitive to plating density and expand more rapidly from single cell derived colonies than human marrow stromal cells.Stem cells，2001，19:219.

［19］Beerelli S，Sanjay K，Debra S.Human bone marrow stromal cell:coexpression of markers specific for multiple mesenchymal cell lineages［J］.Blood Cells Mo Dis，2000，26(3):234 ～246.

［20］Pittenger M F，Mackay A M，Beck S C，et al，Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells［J］.Science，1999，284(5411):143～147.

［21］Sanchez-Ramos J，Song S，Cardozo Pelaez F，et al.Adult Bone marrow stromal cells differenitiate into neural cells in vitro ［J］.Exp Neurol，2000，164(2):247～256.

［22］Hou L，Cao H，Wang D，et al.Induction of umbilical cord blood mesenchymal stem cell into neuron like cells in vitro ［J］.Int J he matol，2003，78(3):256～261.

［23］李念龍，于占革.骨髓間充質干細胞移植治療脊髓損傷的研究進展.中國矯形外科雜志，2012，20(4):343-345.

［24］孫琦，王燦斌，劉繼春，等.骨髓間充質干細胞治療骨關節病及脊髓損傷的研究進展.中國組織工程研究，2012，16(36):6820-6826.

［25］王格，武棟成.骨髓間充質干細胞移植治療脊髓損傷的應用技術.中國組織工程研究，2012，16(23):4354-4358.

［26］代喜平，馮梅，盧愛麗，等.間充質干細胞移植治療脊髓損傷患者的療效分析.中國康復醫學雜志，2012，27(6):538-541.