蜜環(huán)菌多糖的研究進展

史國生，程春雷

(山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南 250101)

蜜環(huán)菌又名榛蘑，是一種在夏、秋季生長，能兼性寄生于多種植物的真菌，屬于擔子菌門、傘菌目、白蘑科。蜜環(huán)菌具有根腐特性，但對某些植物如中藥天麻和豬苓，必須依靠蜜環(huán)菌的侵染才能生長繁殖[1]。蜜環(huán)菌含有氨基酸、微量元素、多糖、倍半萜類化合物等成分，其中蜜環(huán)菌多糖是蜜環(huán)菌具有多種藥理活性的主要物質基礎[2]。現(xiàn)將其活性多糖的理化性質、藥理作用等方面的最新研究進展報道如下。

1 蜜環(huán)菌多糖的成分

由于蜜環(huán)菌的培養(yǎng)方法、提取工藝不同，不同學者得到的結果也不盡相同。洪毅等[3]從蜜環(huán)菌菌索中分離得到的多糖，經(jīng)水解確定產(chǎn)物為D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-木糖和半乳糖醛酸。余晨晨等[4]利用紫外、紅外光譜、氣相衍生化分析蜜環(huán)菌發(fā)酵液中水溶性多糖的結構，結果表明，水溶性多糖成分單一，均為吡喃型葡萄糖。劉曉杰等[5]采用分布醇沉和葡聚糖凝膠(Sephadex G-200)色譜法對蜜環(huán)菌發(fā)酵液進行分類純化，用高效液相色譜(HPLC)法進行分子量測定，采用1 -苯基-3-甲基-5 -吡唑啉酮將單糖進行衍生測定。此方法共獲得2 種均一性多糖(AMFP-1，AMFP-2)，峰位分子量分別為812939 和596217，AMFP-1 主要由半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖組成，而AMFP-2主要由半乳糖醛酸、半乳糖、木糖組成。

2 蜜環(huán)菌多糖提取工藝的優(yōu)化

蜜環(huán)菌多糖具有較多的活性，因此其提取工藝也成為研究熱點。武錄平等[6]用熱水浸提法和超聲波提取法對蜜環(huán)菌子實體進行了對比研究，并采用三因素三水平的正交試驗將提取條件進行了優(yōu)化，最佳工藝參數(shù)為料液比1 ∶50、溫度40 ℃、提取時間6 h，得率達5.96%;超聲法提取的最佳工藝參數(shù)為料液比1 ∶30、超聲時間35 min、功率360 W，提取率比水提法略低。隨著提取工藝研究的不斷深入，張帆等[7]在單因素試驗的基礎上，選取超聲時間、超聲溫度、液固比3 個因子進行三因素三水平的Box-Behnken 中心組合設計，以多糖提取率為響應值進行試驗，并用響應面分析方法對工藝參數(shù)進行優(yōu)化，得到的優(yōu)化提取工藝條件修正后為液固比10 ∶1、超聲時間22 min、超聲溫度77 ℃，最終蜜環(huán)菌多糖的提取率采用超聲后其提取率升高了10%左右。這主要是由于超聲波促使樣品中偶極分子旋轉而導致弱氫鍵破裂及離子遷移，加速了溶劑對樣品的滲透，并使多糖溶解于溶劑中;此外，超聲具有生物效應，會引起樣品細胞膜破裂，從而加速多糖從細胞中的釋放。也有研究表明，在水提取法的基礎上進行超聲優(yōu)化，多糖得率可增加6%左右，可將超聲波法作為蜜環(huán)菌多糖提取的輔助手段。

3 蜜環(huán)菌發(fā)酵條件的優(yōu)化

蜜環(huán)菌的發(fā)酵條件對其多糖的含量有重要影響。余晨晨等[8]以苯酚-硫酸法測定多糖得率為評價指標，系統(tǒng)地研究了蜜環(huán)菌的最適氮源。研究結果表明，紅薯粉和豆粕組合時最適合產(chǎn)多糖，玉米漿和玉米粉的組合菌絲體的得率最高。發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳氮源是影響多糖產(chǎn)量的重要營養(yǎng)要素，在試驗中，通過對14 種不同類型的碳氮源系統(tǒng)的進行篩選，發(fā)現(xiàn)天然類培養(yǎng)基的多糖和菌絲體得率明顯高于一般合成類的碳氮源。也有學者從篩選菌株開始，確定了最佳液體發(fā)酵培養(yǎng)時間和碳源、氮源的組合。研究結果表明，菌株的最佳發(fā)酵時間為7 d，根據(jù)菌絲干重和多糖得率綜合分析，最適碳源和氮源組合為糊精+紅薯粉，蠶蛹粉+玉米漿。溫剛等[9]以蜜環(huán)菌胞外多糖為指標，對基本培養(yǎng)基組分進行了優(yōu)化，具體的培養(yǎng)基組成為:蔗糖25 g/L，豆餅粉2.5 g/L，K2HPO41.5 g/L，KH2PO40.25 g/L，MgSO40.5 g/L，ZnSO40.03 g/L，F(xiàn)eSO40.02 g/L。利用此培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖產(chǎn)量可達478.5 mg/L，是基本培養(yǎng)基的6 倍。

4 蜜環(huán)菌多糖的藥理活性

4.1 降糖作用

操玉平等[10]根據(jù)純化時洗脫液的不同，得到了水相(AMP-1)和鹽相(AMP-2)2 種組分。研究表明，AMP-1 能明顯降低四氧嘧啶糖尿病小鼠的血糖，且可使正常小鼠的糖耐量增加;同時，一定濃度的AMP-1 對四氧嘧啶損傷的大鼠胰島素瘤細胞的分泌胰島素和C 肽具有一定的促進作用。為進一步研究其降糖機制，徐寶奎等[11]以四氧嘧啶損傷胰島素細胞，在培養(yǎng)液中加入AMP-1。結果表明，AMP-1 能劑量依賴性地提高細胞存活率，當質量濃度為400 mg/L 時，能恢復至正常水平。運用熒光顯微鏡、流式細胞儀進行檢測表明，四氧嘧啶會導致胰島素細胞凋亡，而AMP-1 具有一定的拮抗作用。通過Western blot 進行凋亡通路分析發(fā)現(xiàn)，四氧嘧啶會使胰島素細胞bcl-2 蛋白表達量減少，bax蛋白表達升高，而AMP-1 的加入會拮抗這種改變。可見，AMP-1可通過線粒體通路拮抗四氧嘧啶引起的胰島素細胞凋亡。

4.2 免疫調節(jié)作用

王惠國等[12]研究表明，蜜環(huán)菌多糖是一種具有提高機體免疫力的免疫調節(jié)劑。小鼠經(jīng)腹腔注射給予不同劑量的蜜環(huán)菌多糖，對照組給予等量的0.9%氯化鈉注射液，每天給藥1 次，給藥14 d。給藥結束后，用腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗、炭粒廓清試驗觀察小鼠吞噬細胞的吞噬能力，采用MTT 法測定小鼠脾臟T 淋巴細胞增殖能力，用血清溶血素形成試驗觀察蜜環(huán)菌多糖對小鼠特異性體液免疫功能的影響。結果表明，腹腔注射蜜環(huán)菌多糖后，小鼠吞噬細胞的吞噬功能、脾臟T 淋巴細胞的增殖能力、小鼠血清中特異性抗體含量均明顯高于陰性對照組(P ＜0.05)。為進一步了解蜜環(huán)菌多糖增強免疫力的機制，王惠國等[13]用形態(tài)學方法測定各組小鼠在植物血凝素(PHA)誘導下淋巴細胞轉化率，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法測定各組小鼠血清中白細胞介素2(IL -2)、轉化生長因子βl(TGF -βl)水平。結果表明，蜜環(huán)菌多糖具有提高小鼠淋巴細胞轉化率，增加血清中IL -2 水平，并同時下調血清中TGF -βl水平的作用[13]。此研究提示，蜜環(huán)菌多糖可通過調節(jié)小鼠免疫細胞及免疫分子的作用，增強小鼠的免疫功能。

4.3 抗阿爾茨海默病(AD)作用

AD 俗稱老年癡呆癥，是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，具體發(fā)病機制不明，但近年的研究發(fā)現(xiàn)，自由基損傷所造成的神經(jīng)元損傷是引起AD 的重要原因之一。有研究報道，復方天麻蜜環(huán)菌片對AD 有一定療效，可顯著提高AD 患者的簡易精神狀態(tài)檢查量表(MMSE)和簡易智能量表(HDS)評分，明顯改善臨床癥狀，降低神經(jīng)功能損傷積分，改善日常生活能力。

為進一步闡明其抗AD 的機制，邱家權等[14]和殷銀霞等[15]研究了蜜環(huán)菌多糖含藥血清對Aβ 25-35 及過氧化氫誘導PC12 細胞的保護機制。邱家權等[14]用蜜環(huán)菌多糖制備大鼠含有血清，在Aβ 25-35 誘導PC12 細胞損傷模型的基礎上加入蜜環(huán)菌多糖含藥血清，采用比色法檢測培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶的活力、丙二醛含量及超氧化物歧化酶(SOD)活力。結果表明，不同濃度的含藥血清對Aβ 25-35 損傷的PC12 細胞的存活率有提高作用，5%濃度的含藥血清可明顯降低乳酸脫氧酶(LDH)活力、丙二醛(MDA)含量，提高SOD 活力。殷銀霞等[15]改用過氧化氫損傷PC12 細胞模型得到了相似的結果。為進一步闡明蜜環(huán)菌多糖的抗氧化作用，朱顯峰等[16]采用分光光度法系統(tǒng)地研究了其對清除羥基自由基(·OH)、超氧陰離子(O2-)和DPPH 自由基能力，并且與抗壞血酸、TBHQ 進行了對比。蜜環(huán)菌多糖對·OH 的清除能力與抗壞血酸、TBHQ 相當，對O2-清除能力優(yōu)于TBHQ，但弱于抗壞血酸，對DPPH 清除能力強于抗壞血酸和TBHQ。武錄平等[17]對蜜環(huán)菌子實體多糖進行了分離純化，將粗多糖通過乙醇沉淀分級得到3 個組分多糖T30、T60 和T80。T30 經(jīng)凝膠柱(sephadexG-150)層析獲得2 個純多糖組分T301 和T302;T60 經(jīng)凝膠柱(s 即hadexG-50)層析獲得一個純多糖組分T601，對蜜環(huán)菌多糖T30I 和T601 進行體外抗氧化試驗。結果表明，2 種多糖都具有一定的抗氧化活性，T301 的效果優(yōu)于T601，表明蜜環(huán)菌多糖的生物活性與多糖的分子量大小有一定關系。以上研究表明，蜜環(huán)菌多糖有較強的清除自由基、抗氧化能力，這可能是其抗AD、延緩衰老的機制之一。

4.4 抗衰老作用

蜜環(huán)菌多糖能部分逆轉D-半乳糖記憶力下降等衰老行為，并能降低小鼠體內NO 和MDA 含量。秀麗隱桿線蟲是廣泛應用于遺傳學、發(fā)育生物學、細胞生物學等領域的模式生物，與人類基因的同源性達到80%，其生命周期短，易繁殖，是進行衰老研究的理想模式生物模型。陳亮穩(wěn)等[18]以生物秀麗隱桿線蟲作為活體模型，測定蜜環(huán)菌多糖對線蟲在正常培養(yǎng)條件下的生存期與后代平均數(shù)量，氧化應激條件下的存活率和熱休克蛋白16.2(HSP-16.2)、SOD-3 的表達影響。結果表明，在正常培養(yǎng)條件下，蜜環(huán)菌菌索多糖(AMP-1 及AMP-2)可顯著延長秀麗隱桿線蟲的生存期，對其生殖力沒有損害;在氧化應激條件下，顯著提高秀麗隱桿線蟲HSP-16.2 和SOD-3 的表達。

4.5 抗癌作用

Wu 等[19]從蜜環(huán)菌體中分離純化了一水溶性多糖，該多糖含用高效凝膠色譜分析其相對分子質量為4.6 ×105，而且主要由D-葡萄糖組成。體外研究發(fā)現(xiàn)，該多糖對A549 腫瘤細胞有很強的抑制作用，能引起腫瘤細胞凋亡，使細胞阻滯在G0/G1期。研究其機制發(fā)現(xiàn)，該多糖能使腫瘤細胞的線粒體膜電位下降，因而使細胞色素C 從線粒體釋放，同時激活caspase-3 和caspase-9，從而誘發(fā)A549 腫瘤細胞凋亡。

5 結語

蜜環(huán)菌是我國傳統(tǒng)的藥食兩用真菌，其在滋補防病的應用歷史悠久。近幾年來，真菌多糖的生物活性越來越引起大家的重視，同樣蜜環(huán)菌多糖的提取、結構鑒定、藥理活性及活性作用機制也成為研究熱點。目前，已有天麻蜜環(huán)菌片、腦心舒口服液等藥品在臨床使用，而且有蜜環(huán)菌飲料、糖漿等保健品上市。隨著蜜環(huán)菌多糖研究的不斷深入，一定會有更多制劑開發(fā)出來，更好地服務于人類健康。

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