酶聯免疫吸附試驗檢測結果的影響因素和應對措施

張春艷

（吉林省白城市中心血站，吉林 白城 137000）

酶聯免疫吸附試驗檢測結果的影響因素和應對措施

張春艷

（吉林省白城市中心血站，吉林 白城 137000）

酶聯免疫吸附試驗；影響因素；應對措施

酶聯免疫吸附試驗（ELISA）是血站檢驗獻血者血液是否符合既定標準的常用檢測方法，其基本方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面進行酶標記的抗原抗體反應，用洗滌法洗除液相中的游離成分。因其具有操作簡單、靈敏度高、特異性好、達納克水平和經濟安全等優勢，廣泛為臨床實踐所應用。但在檢驗實際操作過程中，在各種主客觀因素的影響下，可影響檢測結果的準確性。為此，筆者總結分析ELISA試驗操作各個環節中容易出現的問題和注意事項，以不斷提高檢驗質量，滿足各種需求。

1 試劑的準備

目前各種ELISA試驗均有商品化的專用試劑盒。應選擇質量優良、有批準文號的檢測試劑，試劑必須在有效期內使用，實際操作時嚴格執行試劑說明書。試劑從冰箱取出后，應放在室溫或37 ℃條件下30 min再進行檢測。保存試劑盒的冰箱應經常檢查儲存溫度并做好記錄，冰箱應避免頻繁開關。試劑使用前應搖勻。

2 標本的采集和保存

血站ELISA試驗所用標本均為血清，臨床上使用的標本還包括經過預處理的唾液、尿液、糞便等生物材料。

對于含有免疫物質的標本，可干擾試驗，使結果出現假陽性或假陰性。干擾因素包括兩類，其中內源性因素包括類風濕因子、補體、高濃度的非特異性免疫球蛋白等，主要通過試劑的合理選擇予以有效避免。外源性因素包括標本溶血和凝固、被細菌污染、儲存時間過長等，實際工作中應采取避免溶血[1]和污染的措施。否則，紅細胞溶解時會釋放具有過氧化物酶活性的亞鐵血紅素的血紅蛋白；應避免污染標本，一旦污染菌體中可能含有內源性HRP，當以HRP為標記時，可增加非特異性顯色而出現假陽性的結果。應保持檢測標本處于新鮮狀態，需低溫保存推遲檢測標本，分別在2～8 ℃和低溫條件下保存7 d內和7 d后檢測的血清標本。同時，反復冰融會使抗體效價降低，需多次測定抗體的血清標本應采用少量分裝并冰存的保存方法。應充分離心血清標本，否則可因纖維蛋白原的殘留使其在微孔吸附而致假陽性結果。

所以，實驗室人員應按要求認真查對血清標本，拒收不符合要求的標本和申請單，為避免溶血要及時分離合格標本的血清，并保證其中不得混有大量纖維蛋白或細胞成分，保證檢測結果的準確性。不能及時檢測的標本要按要求保存并作好記錄，標本從冰箱取出后要按常規處理用于檢測。

3 加樣、育溫、洗滌、顯色和比色

3.1 加樣：在試驗操作中，加標本、加酶結合物和加底物為循序漸進的加樣流程。前者一般采用手工或者微量加樣器的方法加樣。但應注意：①每次手工加樣前必須更換吸嘴以避免交叉感染；②為保證準確加樣，應揣摩并熟練掌握加樣技巧；③必須定期維護和校準加樣器，因為使用時間過長，因機械磨損或推動桿內血痂附著等原因造成加樣不準。加酶結合物和底物可直接滴加，一般不用微量加樣器。每次加樣時，為避免加在孔壁上部，應置所加物于ELISA板孔的底部，不得出現濺出、產生氣泡等現象，加酶試劑后要用吸水紙輕輕擦拭吸干酶標板。加底物操作時，不得混用各試劑盒顯色劑，不得顛倒添加順序，不得濺出孔外。較多標本時，為避免因加樣板過多所致加樣后等待時間過長放入孵箱，尤其在較高室溫條件下操作要分批進行。最后為保證混勻，在微型振蕩器上震蕩1 min。

3.2 溫育：酶聯免疫吸附反應是在固相表面發生的一系列反應，只有經過擴散后抗原抗體結合才能達到反應的終點，可見溫育需要一定時間，也是檢測結果的關鍵影響因素之一，最為明顯的是弱陽性標本[2]。水浴法、微波輻射法和溫箱法為最常用的溫育方式，第一種方法能較好地解決周圍孔與中央孔因受熱不均衡所致吸光度誤差。37 ℃適合大多數抗原抗體反應是最常用的溫度，另外尚可采用是4 ℃、室溫和43 ℃。為了迅速平衡各板溫度，可使反應板漂浮在水浴箱水面上，但不得疊放；反應板應加蓋或貼封紙，目的在于防止標本或稀釋液蒸發在孔壁上吸附。應準確掌握溫育的溫度和時間，因為溫度不準影響反應過程，時間過長可在反應孔周圍出現非特異性結合導致花板，這難以徹底洗滌。

3.3 洗滌：影響ELISA檢測結果準確性的關鍵因素之一是洗滌。操作者應嚴格按照要求洗滌，將游離酶標志物和結合酶標志物分離開來，可以將殘留在板孔中沒有參與反應的物質和反應過程中吸附于固相載體的干擾物質予以清除。要按要求設置自動洗板機洗板的時間、間隔、次數，次數較少可造成殘留出現假陽性結果，次數過多可洗脫抗原抗體結合物出現假陰性結果[3]。要保證洗液注滿各孔，防止在反應孔中形成氣泡而造成洗滌不充分。洗板結束后，應在干凈無塵的吸水紙上輕輕拍干。如洗液量不足，影響洗板效果，可堵塞洗板針，不完全抽吸，洗板不暢，不能徹底洗板。

3.4 顯色：顯色是酶催化底物由無色到有色的過程，影響檢測結果準確性的因素為反應的溫度和時間。在一定時間內，溫度適當提高，陰性孔可保持無色，隨時間延長陽性孔則呈色加強。在定量檢測中，力求準確掌握底物加入后的反應溫度和時間。為減少實驗誤差，提高臨界值樣本的分析準確度，因肉眼直接判斷結果存在個體差異應盡量避免，最好通過酶標儀觀察測定顯色結果。應注意，加顯色劑時，要保持顯色劑不外流。加終止液時應避免產生較多氣泡，否則可能使假陽性結果的出現概率增加。

3.5 比色：目視法簡單明了，但對同一標本結果判定有一定的個體差異，甚或截然不同的結果。比色的結果通常用光密度表達，現按規定用吸光度表達。但不應在陽光或強光照射下安置酶標儀，應在15～30℃室溫條件下進行操作，使用前要先預熱15～30 min儀器，確保檢測結果的準確性。比色前，應將板底附著的液體用潔凈的吸水紙擦拭干凈，然后將其放在酶標儀的比色架上。

4 固相載體和抗原

4.1 固相載體：進行酶標記測定的基本條件是吸附于固相載體中的可溶性抗原或抗體變為不溶形式，聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反應板及塑料管為常用固相載體。微量反應板所用試劑量少，操作方便，但每批微量反應板對抗原或抗體蛋白質的吸附性能是有顯著差別的。因此，在使用每批制品前，必須經過實驗室鑒定合格后方可使用。鑒定的方法：按規定隨機抽取每批固相載體，包被用0.2 μg/mL純化正常人IgG，洗滌后加酶標記抗人球蛋白進行反應，再經孵育洗滌，加底物顯色終止反應后，在酶標比色計中逐孔測定其消光值和光密度值。鑒定標準：一般認為，全板中每兩孔間光密度值誤差在10%以下為合格；如果中間孔光密度值與四周孔相差較大，或者反應板的一邊光密度值與另一邊凹孔相差較大，均不合格；檢查陽性和陰性參考血清光密度值的差異在10倍左右為合格。微量反應板或塑料管在使用前用蒸餾水沖洗即可應用，不一定經過特殊處理。

4.2 抗原：抗原或抗體包被于固相載體表面，其來源和制備方法可影響檢測結果的準確性?？乖蟊仨毧扇?、優質和穩定，具有高純度和高免疫原性。當抗原純度不高時，其中的雜質會競爭固相載體上的有限位置，使其敏感性和特異性下降；制備包被抗原時，其免疫學活性不應受到破壞。一般能用于補體結合試驗的可溶性抗原均可用于ELISA，在作ELISA時，必須要有1～2種試劑、要求純化，但在包被用表面活性劑提取的抗原前必須將表面活性劑透析除去，否則難以吸附到固相載體上。包被固相載體時要用濃度適當的抗原或抗體蛋白，如濃度太高則抗體效價低，可能測不出來；過量包被形成多層抗原吸附，可能造成脫落，檢測結果的敏感性和可重復性得以降低。

5 實驗人員素質因素

人員素質是影響檢驗結果的首要因素。思想素質、業務素質、心理素質、身體素質組成實驗室人員的主要素質。首先，實驗人員的思想素質應良好，因為其服務對象包括獻血者和受血者，其道德水平直接關系到人們的健康和生命安危。所以，必須應該熱愛專業，耐心細致，一旦出現如標本混淆、報告單記錄錯誤等現象，可能危害受血者的身心健康；其次，實驗人員應有高超的業務素質。要熟練掌握本專業的基本理論和基本操作技能，認真學習檢驗醫學前瞻性知識，不斷提高自己的業務能力和水平，適應崗位需求。心理素質要求檢驗人員應勇于面對工作生活中的挫折和壓力，有條不紊，冷靜沉著地開展各項檢驗工作。

綜上所述，保證ELISA檢測結果準確可靠的必要條件是具有優質的試劑，良好的儀器和正確的操作。在實際應用過程中，操作者必須熟練掌握基本操作技能，嚴格仔細的核查每個環節，盡量避免假陽性和假陰性反應的出現，保證檢測結果真實可靠。

[1] 孫鑫,陳彥,張繼瑜,等.不同程度溶血對ELISA法檢測血清HBVM的影響[J].世界感染雜志,2004,4(2):174-176.

[2] 徐錫霞,鄧巍.溫育條件對ELISA定性測定HBsAg結果的影響[J].實用肝病雜志,2005,8(1):16-18.

[3] 劉祖勇.增加洗板次數對HBsAg ELISA檢測影響[J].中國輸血雜志,2006,19(2):135-136.

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1671-8194（2014）29-0393-02