酶標免疫實驗假陰陽性的原因探析

王有美

（平湖市第一人民醫院，浙江 嘉興 314200）

酶標免疫實驗假陰陽性的原因探析

王有美

（平湖市第一人民醫院，浙江 嘉興 314200）

現代醫學檢測技術在過去的幾十年有了飛速的發展，一些先進的實驗檢測在學校和醫學研究所等地方較為常見，研究酶標免疫實驗有助于提高我國實驗檢測技術。酶標免疫是通過相應的特異性抗體對組織及細胞中的抗原或半抗原進行檢測。然而，假陰陽性是酶標免疫實驗中較為常見的現象，分析其產生原因有著重要的意義。本文主要結合實際實驗經驗，從遇到的假陰陽性進行分析影響因素，從而提出避免酶標免疫實驗出現假陰陽性的具體措施，為實際實驗提供參考和指導。

酶標免疫實驗；假陰性；假陽性；原因；改善措施

隨著現代檢測技術在醫學實驗中的普遍使用，實驗檢測能夠更好的為醫院、學校和科研單位提供服務[1]。酶標免疫實驗在實際中有著廣泛的應用，屬于較為常見的實驗檢測技術，它在病理診斷時起到重要輔助作用[2,3]。檢測過程中每一步的規范直接關系到到檢測結果的準確性，從而在某些程度影響到病理常規診斷，這就要求酶標免疫實驗做到嚴格的規范，防止出現不準確的檢測結果[4]。假陰性和假陽性是酶標免疫試驗檢測中最容易出現的現象，直接影響了酶標免疫試驗檢測準確性[5]。本文主要分析了酶標免疫實驗中影響假陰陽性的因素，并結合實際工程分析了改善措施，為實際酶標免疫試驗檢測提供指導，提高實驗檢測水平。

1 酶標免疫試驗檢測假陰陽性原因分析及改善措施

假陰陽性現象在酶標免疫試驗檢測中是一個綜合現象，該現象不僅與實驗操作有關，而且與涉及實驗結果的各個細節都有影響，在實驗檢測中較為常見。

1.1 手術標本固定是否充分

標本在送來時馬上對標本所在腫瘤位子剖開，讓固定液能夠充分滲透到組織中去，以保證組織中抗原不被丟失，而且固定液最好用中性福爾馬林（研究表明中性福爾馬林能夠最大程度的保存組織中的抗原），若組織固定的不好，有些組織切片本身抗原含量低的時候，檢測結果就有可能顯示假陰性的結果，因此組織的固定是前提條件，它在酶標免疫試驗過程中起到至關重要的作用。

1.2 組織修復是否恰當

首先要選擇什么抗原修復液是關鍵，組織必須用充分抗原修復來打開抗原表位，以利于與抗體結合；一般像細胞質著色的抗體就用檸檬酸修復即可，細胞核/膜著色的抗體用EDTA修復，但主要還要看實際情況，比如有時候試劑的效價低時可適當延長修復時間或者改用EDTA修復來改善，通常情況下用微波爐修復是最方便和節約試劑的，這也是大多數研究單位首選方式，先用高火10 min，再轉中火10 min，同時修復時必須保證溫度始終達到98 ℃以上（實驗時必需保證所用微波爐能夠達到所需溫度），修復結束后置于常溫下自然冷卻；經過我多年反復實驗，我發現微波修復過程中修復液容易因為持續高溫而往外崩，這樣容易導致組織片浸不到試劑而暴露在外，就會導致掉片、組織背景出現非特異性著色、該著色的部位假陰性等等一系列問題，因此我建議用高壓修復最佳，這樣就會避免以上出現的問題，而且修復時溫度始終達到100 ℃效果更佳。

1.3 動物免疫血清及過氧化氫的封閉

在組織中非特異性染色是常有的現象，這需要通過動物免疫血清來封閉，一般10～30 min，但是可適當延長時間和適當增加濃度來加強封閉效果，如組織中含較多血細胞（肝脹、腎等組織）就要通過過氧化氫來滅活內源性過氧化物酶以降低背景染色。

1.4 組織的清洗過程

實驗時，一抗和二抗的清洗也很重要，PBS清洗不充分，殘留抗體結果增強著色，因此以PBS清洗不斷地延長時間和增加次數來保證清洗干凈，而且最好采用沖洗的方式以避免浸洗時多種抗體交叉結合，造成非特異性染色。

1.5 使用試劑和蒸餾水

在實驗操作過程中抗體是最重要兩個原因之一，其濃度和質量必需得到首要保證，一抗用多克隆抗體易出現非特異性著色，建議試用單克隆抗體。現在試劑公司的一抗有即用型和濃縮型，即用型一抗因為試劑的時間和濃度的限制不能調節，所以現在濃縮型抗體為首要選擇，使用時要根據抗體的效價及有效期來調整抗體的稀釋度，當然，不是抗體濃度越高就越易出現陽性結果，抗原抗體反應有前帶和后帶效應，必須摸索最佳濃度；實驗時二抗要選擇與一抗來源一致的型號，一般情況下選廣譜二抗，這樣單克隆及多克隆一抗都適用，再者實驗時所有試劑都要用蒸餾水來配置，以避免普通水的pH值及其當中雜質的影響，造成非特異性染色。

1.6 DAB顯色劑的使用

DAB孵育時間要恰當，過長會使片子整個背景都著色而出現假陽性的情況，過短DAB與鏈接酶之間結合不充分，會出現假陰性的情況，一般顯色時間控制在8～10 min，但是也要根據具體組織片來判斷，因此在顯色時最好在顯微鏡下操作，這樣能更好掌控顯色的程度；在配置DAB時，不是濃度越濃越好，DAB原液與過氧化氫液要1∶1的比例才最佳，以前實驗經常有這樣的錯誤的認知，認為DAB原液的比例越高越好，其實不然，DAB原液的濃度過于的高于過氧化氫的濃度反而會使組織著色變弱，從而影響結果判斷。

1.7 實驗室環境及組織孵育時間的掌控

酶標免疫組化要求實驗室環境非常嚴格，組織必須在恒溫37 ℃，濕度合適的環境下進行，一般情況下一抗、二抗的孵育時間分別為1 h和30 min，不過經過不斷的實驗和總結，我建議一抗4 ℃孵育過夜，這樣能使組合織中的抗原與抗體充分結合，而得到最佳顯色效果，在實驗室整個操作過程中要保證組織不要干片，所以在一抗4 ℃孵育過夜時，必須要用專用的薄膜蓋在組織片上，保證試劑長時間在4 ℃低溫下不干片，要不然會出現組織的非特異性染色。抗體孵育時間過長、抗體濃度高易增加背景著色，這可通過縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制。這是很重要。

2 總 結

以上原因，都是針對實際中常見原因來進行分析的，前提是排除操作者的操作錯誤而引起假陰陽性結果，這就需要新手還是要設置陰、陽性對照以排除方法的問題。還有抗體稀釋液的pH值過低及抗體質量等其他原因的干擾。總之，要想把免疫組化做好，可能每一個環節都很重要，但也存在主次之分，出現問題了，需要通過先排除主要的，再依次排除次要的-這是衡量你對免疫組化原理掌握與否的關鍵所在。

實驗中，必須根據容易導致假陰陽性的因素，具體針對每種因素進行分析，改善每種可能引發假陰陽性的操作，從而最大程度的保證實驗結果的準確性。

[1] 張凈.酶聯免疫吸附試驗檢測被檢血清的一種非特異性來源-γ-輻射[J].中國動物檢疫,1988,5(2):55.

[2] 鳳婧,陶傳敏,嚴可寧,等.ELISA一步夾心法檢測HBsAg假陰性原因分析[J].華西醫學, 2008,23(6):1394-1395.

[3] 薛春楊,周建波.ELISA法乙肝兩對半檢測影響因素分析和臨床意義[J].中國誤診學雜志, 2011,11(16):3913-3914.

[4] 易金平.酶聯免疫吸附試驗技術的影響因素分析[J].檢驗醫學與臨床,2010,7(22):2553.

[5] 杜艷霞.酶聯免疫吸附試驗測定操作的體會[J].中國實用醫藥, 2009,4(27):139-140.

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1671-8194（2014）17-0384-02