胰島β細胞發育相關轉錄因子研究進展

相 磊，袁記方，黃麗潔

(中國人民解放軍總醫院醫學實驗動物中心，北京 100853)

胰腺是人體內唯一同時具有內分泌與外分泌兩種分泌功能的器官。胰腺的內分泌功能由Langerhans小島(即胰島)中的許多不同類型的內分泌細胞完成，這些內分泌細胞主要包括α細胞、β細胞、δ細胞和PP細胞等。內分泌細胞在胰腺細胞總數中占較小的比例，研究顯示在成年大鼠中內分泌細胞約占4%[1]。胰島β細胞主要具有分泌胰島素的功能，胰島素是調節血糖濃度、促進合成代謝、調節細胞分化和生長發育的重要激素，體內胰島素的絕對或相對不足，將導致糖尿病的發生。糖尿病目前在我國的發病率高達11.6%，已經成為我國的一項嚴重公共健康問題。胚胎期胰腺的正常發育關系著成年期生物學功能的發揮，因此，對胰島β細胞發育的研究可以為糖尿病的臨床治療提供基礎資料。

1 胰腺β細胞的胚胎發育

胰腺起源于腸管內胚層(gut endoderm)，它是脊椎動物原腸胚形成后三個胚層之一，經過一系列的信號調節和逐級轉錄因子調節最終發育為成熟的器官。大鼠的胰腺產生最早是在胚胎的E8～E8.5 d，在胚胎的第E13.5 d大部分分泌激素細胞(α、β、δ和PP細胞) 開始出現并組成內分泌胰島[2]。胰腺β祖細胞的發育成熟需要經過兩次的細胞躍遷，首先在Sox9、Sox4、NKx2.2、NKx6.1、GATA4、GATA6、Hlxb9、Pdx1、Ptf1α、Tcf2、Foxa2與HNF6等因子的調控下形成第一代胰腺祖細胞。繼而經過Sox9、Sox4、GATA6、Pdx1、Tcf2、Foxa2與HNF6等轉錄因子的調控形成第二代胰腺祖細胞，第二代胰腺祖細胞在Ngn3、Pdx1、Arx、Pax4、Pax6、NKx2.2和NKx6.1的調控下發育為幼稚型的胰腺β細胞，最后幼稚型胰腺β細胞在Nkx6.1、Pdx1、ISI、MafA、Pbx1、Hlxb9等轉錄因子的調控下發育為成熟的胰腺β細胞。

2 胰腺β細胞的發育調控

2.1 Pdx1

Pdx1基因(pancreatic-duodenal homeobox 1 gene，Pdx1)中文譯名為胰十二指腸同源盒基因-1，是同源盒家族中的一員，Pdx1還有許多其它命名，如胰島素啟動子因子-1(IPF-1)、胰島/十二指腸同源盒-1(IDF-1)、生長激素抑制激素轉錄因子-1(STF-1)、胰島素上游因子-1(IUF-1)和葡萄糖敏感因子。

Pdx1在胚胎發育過程中促進胰腺的早期發育和晚期β細胞分化，在成熟β細胞中，Pdx1具有維持β細胞的形態和正常功能，尤其是維持胰島素分泌基因的正常運行。它也是胰腺發育必要的轉錄因子以及β細胞形成和成熟的標志。Pdx1表達于小鼠胚胎E8～E9 d的前腸管上皮，在E9～E10 d胰腺前體與胰腺上皮細胞內均有表達，人類在孕后3～4周Pdx1開始表達，7周有胰島素的產生，12～13周胰島生成。在Pdx1基因敲除的小鼠與其單基因突變的人中均表現為胰腺發育不良[3-4]。敲除Pdx1基因的模型胰腺，其向外生長和近十二指腸的分化完全消失，但仍有胰芽內分泌α細胞的分化，而且對胰腺間質不產生影響[5]。在妊娠中期無內分泌細胞出現的時候，Pdx1呈現低水平的表達，但是在妊娠的中后期胰腺β細胞出現時，Pdx1呈現高水平的表達。這也證實了Pdx1在胰腺的形成與β細胞分化方面都起著重要的作用。此外，Pdx1還是胰腺β細胞內調節葡糖糖反應的重要因子，通常情況下低血糖可以抑制 Pdx1基因表達。短期的血糖升高可以一定程度地刺激Pdx1基因表達，但長期的高血糖則使Pdx1基因表達明顯受抑。

2.2 Ngn3

神經元素3(neurogen in 3，Ngn3)是NOTCH信號通路下游的一種BHLH轉錄因子，在CNS和胰腺中都有表達，Ngn3是胰腺內分泌細胞分化的重要調控因子，研究證實胰腺所有內分泌細胞的發育均需要Ngn3的調控。Ngn3缺失的小鼠出生后無胰島[6]。然而最近在斑馬魚的研究中胰腺與Ngn3缺失的胚胎中Asclb與Neuro1替代了Ngn3的功能，胰腺發育并不表現出缺陷，這提示在脊椎動物中存在其他內分泌細胞分化調節因子[7]。Ngn3最早在小鼠胚胎中表達于E9 d，在E15 d時達到峰值，然而在E17.5 d時Ngn3在胰腺內幾乎消失。Ngn3的表達受到Notch信號的抑制，Notch信號能夠促進Sox9基因的表達，當Sox9基因表達的時候能夠激活胰腺內分泌前體細胞Ngn3基因的表達，然而當Notch信號高水平表達的時候則會激活Sox9的抑制物HES-1D的表達從而終止Sox9基因的表達，進而抑制了Ngn3的表達[8]。Ngn3調控著與胰島發育相關的3755個基因，其中有317個基因對胰腺內分泌細胞的發育起正向調節作用，175個基因起負向調節作用，757個基因在內分泌細胞發育中是否具有表達還沒有確定[9]。

2.3 Pax

2.3.1 Pax4

胰島β細胞功能密切相關的胰島特異性轉錄因子-配對盒4(paired box4,Pax4)屬于編碼促進胚胎細胞增殖、分化及存活的轉錄因子家族。這類因子參與細胞內信號傳導的高級調控，在胚胎發育過程中對細胞分化、更新、凋亡等都起著十分重要的調控作用。Pax4生理條件下對胰島β細胞的生存和增殖具有至關重要的作用，同時Pax4基因的多態性與糖尿病的發生相關。

Pax4是早期內分泌祖細胞的標志，他主要指導β/δ系細胞的分化。胚胎發育過程中，Pax4轉錄最初在E9.5 d的胰腺胚芽中出現，胚胎E13.5～E15.5 d時達到高峰，然后下降至低表達水平。通過基因打靶技術提示，Pax4的缺乏可以導致胰島β細胞和δ細胞的成熟障礙和胰島α細胞的大量增加[10]。其中胰島α細胞的增加一方面由于胚胎時期被Pax4抑制的α細胞特異性轉錄因子Arx的表達增加。另一方面，Pax4的缺乏可以促使成體β細胞向α細胞和PP細胞轉化。Pax4還能提高成熟β的數量，通過抑制Pax6減少α細胞分化從而減少胰高血糖素的分泌。

2.3.2 Pax6

Pax6在脊椎動物的眼、腦和胰腺的發育過程中起著重要的作用。在Pax6b缺失的斑馬魚研究中證實在胰腺內分泌細胞分化過程Pax6b缺失的胚胎中不會發育生成β細胞，δ細胞大量減少，ε細胞呈現明顯的增多。對Pax6b功能不全的胚胎適度注射Pax6b嗎琳代能夠顯著提高α細胞的數量與胰高血糖素的水平[11]。在小鼠胚胎的E10 d，Pax6表達于內分泌祖細胞，Pax6能夠調控內分泌激素的轉錄，能夠刺激內分泌細胞特別是α細胞的增值。此外Pax6還能夠抑制胃饑餓素的分泌。

2.4 Nkx

2.4.1 Nkx6.1與Nkx6.2

同源異性框基因Nkx6.1與Nkx6.2在胰腺β細胞的發育與功能執行中發揮著重要的作用。研究顯示Pdx1與Ngn3雙陽性前體細胞是內分泌細胞共同的前體細胞群,但缺少Nkx6.1在胚胎發育時期會導致β細胞形成異常,而不影響胰腺中其他細胞的分化與發育[12],該研究提示β細胞分化可能也需要Nkx6.1因子在Pdx1陽性前體細胞中持續表達。Nkx6.1在成熟β細胞表達，以此維持著β細胞的正常功能，與此相比Nkx6.2僅表達于胰高血糖素與淀粉酶陽性細胞內，在胚胎發育的E15.5 dNkx6.2的表達將會終止。在Nkx6.1缺失的突變體小鼠中胚胎發育E13 d后無胰島素陽性細胞產生，致使β細胞的形成降低了85%[13]。在Nkx6.1與Nkx6.2雙基因缺失的小鼠中95%的胰腺β細胞喪失，這充分的證實了Nkx6.1在胰腺β細胞發育中的作用，同時證實在胰腺祖細胞形成β細胞過程中Nkx6.2能夠代償部分Nkx6.1的功能。通過轉基因技術在Nkx6.1基因缺失的小鼠中在含有Pdx1啟動子而無Ngn3啟動子下表達Nkx6.1或Nkx6.2能夠有效的修復β細胞的的損失。該項研究也證實了Nkx6.2能夠代償Nkx6.1的功能[14]。

小鼠中研究證實Nkx6在胰腺α細胞與β細胞的分化中扮演著重要的角色。Binot等在斑馬魚中研究證實Nkx6.1與Nkx6.2共表達于胰腺初級內分泌祖細胞內，但是他們表達的層次不同，Nkx6.1主要表達于形成胰島的腹側，Nkx6.2主要表達與胰腺β細胞內。在斑馬魚中敲除Nkx6.1或Nkx6.2則表現為α細胞的完全缺失，而對β細胞，δ細胞和ε細胞沒有產生影響。Nkx6.1或Nkx6.2全部敲除時則表現為β細胞會呈現劇烈的減少[15]。

Nkx6.1與Nkx6.2在胚胎的E9.5 d表達于所有的上皮細胞。E11-E13天Nkx6.1表達于所有Pdx1陽性細胞，但是Nkx6.2不表達。Nkx6.2在胚胎發育的E15 d表達于腺細胞與部分胰高血糖素素細胞內。Pdx1陽性細胞在Nkx6.1與Nkx6.2調控下才能轉化為胰腺β細胞。Nkx6.1是β細胞成熟與增值必不可少的一個調控因子。在α細胞的發育過程中Nkx6.1與Nkx6.2也是必不可少的調控因子。

2.4.2 Nkx2.2

Nkx2.2最先表達于胚胎發育的E9.5 d，至E10.5 d半數胰腺上皮細胞均有Nkx2.2的表達，在以后的發育階段中Nkx2.2主要表達于除δ細胞的Ngn3陽性細胞內。值得注意的是在Nkx2.2缺失的小鼠中無胰腺β細胞的產生，α細胞減少80%，PP細胞適量減少，δ細胞不能執行正常生理功能[16]。有研究證實Nkx2.2能夠結合與激活MafA基因從而對胰腺β細胞的分化與形成起到重要的作用[17]。在斑馬魚研究中證實Nkx2.2能夠增強導管細胞的形成。

2.5 ArX

磺胺異二甲嘧啶相關同源異型盒(Arx)基因首先是在小鼠神經系統內發現的。最初在E9.5 d胰腺上皮細胞中表達，Arx的表達限制了胰腺內分泌細胞的類型。如果Ngn3敲除則不會表達Arx，這證實Ngn3是位于Arx上游的基因。Arx在形成α、β、δ與pp細胞正常的比例中起到重要的作用。當Arx基因缺失時，δ細胞數量會明顯增高，α細胞明顯減少[18]。Arx基因主要是促進α細胞的分化并且抑制β與δ細胞的分化，Arx與Pax蛋白的相互抑制作用，在Arx基因缺失的突變小鼠中無α細胞的分化，α前體細胞傾向于轉化為β與δ細胞[19]。與此相反在Pdx1陽性細胞中Arx基因過表達則會使β與δ前體細胞傾向于轉化為α與PP細胞。

2.6 MafA與MafB

Maf蛋白屬于巨噬細胞激活因子(macrophage-activating factor, Maf)家族，是API家族在胚胎發育和腫瘤生成中發揮不同功能的一種基本的亮氨酸拉鏈轉錄因子(bZIP)。

MafA是v-maf原癌基因家族的成員,是唯一特異存在于胰島β細胞的轉錄因子。在胚胎形成時期,MafA與MafB共同表達于胰島素陽性的β細胞,而在成人胰腺中,僅MafA表達于β細胞, 參與調節胰島素合成、分泌和糖代謝等相關基因的表達。MafA蛋白的分布和其他轉錄因子有所不同，它是β細胞胰島素基因活化轉錄因子，胰腺β細胞的成熟和功能的維持都有賴于MafA蛋白的正常表達。MafA不是β細胞形成所必須的一轉錄因子，但卻是β細胞作為胰島素調控基因功能的必需因子。MafA在血糖調節胰島素基因表達的過程中發揮著重要作用,葡萄糖濃度的變化可在多個水平調節MafA的表達水平及功能活性。在糖尿病狀態下,MafA 的表達和( 或 )活性減低,抑制了胰島素的生物合成和分泌。MafA與胰島素陽性細胞是從MafB與胰島素陽性祖細胞分化而來的[20]。在第二次細胞躍遷中MafA首先表達于胰島素陽性細胞內。當β細胞從未成熟狀態轉化為成熟的細胞后，MafB將終止表達。在MafB基因缺失的突變體中胰島素陽性細胞與胰高血糖素陽性細胞的發育將會延遲，并且這兩種細胞的數量將會減少50%，這些研究證實MafB是調控α、β細胞成熟的一個重要因子。

3 胰島β細胞發育相關轉錄因子的應用

近年來，人們利用與胰島發育相關的轉錄因子將胰腺干細胞定向分化為β細胞，或將非胰島素分泌細胞轉分化為胰島素或類胰島素分泌細胞，這在糖尿病治療方面表現出了巨大的潛力。

構建含有Pdx1基因的真核表達載體，轉染介質Superfect介導重組載體轉染骨髓間充質干細胞(MSCs)，能增強大鼠MSCs體外分化為功能性胰島素分泌細胞的能力，對開展胰島移植治療1型糖尿病有重要價值[21]。經Ngn3蛋白誘導的大鼠骨髓間充質干細胞出現細胞聚集生長現象，并有形狀類似胰島β的細胞團出現[22]。

胰島的發育是許多轉錄因子在時空上選擇性表達的結果, 通常用一種轉錄因子并不能將非β細胞很好地誘導分化為成熟的、能夠替代β細胞的胰島素分泌細胞, 因此, 目前的常用方法是將幾種關鍵的轉錄因子共轉染非β細胞, 使其定向分化為成熟的β細胞。如構建含 Pdx1與Nkx6.1雙基因的重組腺病毒載體，用該載體分別感染人胎肝間充質干細胞和骨髓間充質干細胞(BMSCs)，并聯合相應的細胞因子分步誘導，研究顯示誘導后的細胞能夠持續穩定的表達胰島素。胰島β樣細胞移植能有效恢復STZ糖尿病小鼠的血糖正常水平,維持小鼠良好的生存狀態[23-24]。Pdx1與Ngn3協同作用誘導肝實質細胞向胰腺β樣細胞分化，證實Pdx1與Ngn3雙基因聯合在誘導細胞轉分化為β樣細胞方面具有協同作用, 可啟動部分β細胞功能相關的基因表達，具體機制尚不清楚[25]。胰島素轉錄關鍵調控因子Pdx1，神經分化因子1(NeuroD1)和MafA三者能協同作用使小鼠iPS細胞分化為具有顯著胰島素合成和分泌能力的胰島素分泌細胞[26]。Ngn3與Pax4對Pdx1誘導間充質干細胞向胰腺分泌細胞分化具有促進作用[27]。

盡管通過廣泛的研究，已經明確了胰腺發育的形態學標志，但是我們只是剛剛才開始了解負責決定胰腺細胞命運的眾多調節因子和細胞間信號分子。胰腺β細胞發育的基因轉錄是一個具有等級或級聯反應的過程，每一個階段都不是單獨的基因在起作用，而是很多基因共同作用的結果。了解胰腺細胞的發育機制可以更好地控制其再生，更加準確地誘導胰腺細胞的發育，從而應用于胰腺組織的再生研究以及糖尿病的臨床治療。但要使誘導形成的胰島素分泌細胞達到臨床治療的要求，還需解決許多的問題。目前，利用轉錄因子將非β細胞誘導為胰島素分泌細胞的研究時間較短，其分子機制尚不清楚，誘導形成β細胞的比率低，且不成熟；人為導入這些轉錄因子，是否會引起細胞的其他癌變；誘導形成的胰島素分泌細胞是否同樣會遭到免疫攻擊，這類問題尚無定論。但隨著胰島β細胞發育相關轉錄因子研究的深入，必將為糖尿病的治療提供更為廣闊前景。

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